恐懼實(shí)驗(yàn)方法

   暗示與關(guān)聯(lián)條件恐懼（cued and contextual fearconditioning）也加場景恐懼實(shí)驗(yàn)，是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶不悅經(jīng)歷（aversiveexperience）和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。常用聲音或光暗示作為條件刺激（conditioningstimulus，CS），以厭惡性刺激（如足電擊）作為非條件刺激（unconditionedstimulus，US），二者配對(duì)出現(xiàn)。經(jīng)過這種CS-US訓(xùn)練，動(dòng)物不僅學(xué)會(huì)聲音和電擊之間存在聯(lián)系，而且知道電擊和周圍環(huán)境之間也存在某種聯(lián)系（context）。前者為聽覺暗示條件恐懼（auditorycue fear conditioning）或暗示條件恐懼（cued fearconditioning），后者為關(guān)聯(lián)條件恐懼（contextual fearconditioning）。恐懼是非靈長類動(dòng)物少有的幾種情感反應(yīng)之一。動(dòng)物經(jīng)歷條件恐懼后，當(dāng)再次接觸條件刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)，包括自主神經(jīng)緊張、應(yīng)激**分泌增加以及防御行為增多，等等。凝滯（freezing）即是動(dòng)物防御行為的一種，是指動(dòng)物除呼吸之外沒有任何其他活動(dòng)，猶如在黑夜處于迎面而來的汽車強(qiáng)燈照射之下的驚鹿，一動(dòng)不動(dòng)。它被認(rèn)為是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物恐懼的可靠指標(biāo)。
 
  參與條件關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)過程的腦部結(jié)構(gòu)主要為杏仁核和海馬。前者調(diào)節(jié)恐懼，后者調(diào)節(jié)與恐懼性事物相關(guān)聯(lián)的學(xué)習(xí)認(rèn)知。所以，這一模型主要用于杏仁核和海馬依賴的記憶。動(dòng)物不需要禁水或禁食，且實(shí)驗(yàn)設(shè)備較為簡單，訓(xùn)練時(shí)間相對(duì)較短。因此，該模型廣泛用于轉(zhuǎn)基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。

 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)備
 
包括條件恐懼箱、隔音箱和關(guān)聯(lián)條件箱，由上海軟隆科技發(fā)展有限公司研
發(fā)。條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯(lián)的電擊發(fā)生器（可產(chǎn)生0.1~1.0mA的各種強(qiáng)度的電擊）、聲音發(fā)生器（可產(chǎn)生寬頻的卡嗒聲或低頻音），并與計(jì)算機(jī)相聯(lián)。隔音箱裝有一燈、一小風(fēng)扇（用于通風(fēng)和產(chǎn)生背景音）以及一個(gè)與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴(kuò)音器。隔音箱門上有一貓眼，用于觀察操作箱內(nèi)的動(dòng)物。一個(gè)隔音箱內(nèi)可放置兩個(gè)操作箱，這樣可同時(shí)觀測兩只動(dòng)物，但兩動(dòng)物彼此不能互相看見。關(guān)聯(lián)箱由透明有機(jī)玻璃制成，有可移動(dòng)的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動(dòng)物滑至格柵下面，格柵條之間距離應(yīng)足夠短。對(duì)小鼠和年幼大鼠，關(guān)聯(lián)條件箱通常為26cm*21cm*10cm；格柵地板由不銹鋼條（直徑1.5mm，中央間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm）組成。對(duì)成年大鼠，關(guān)聯(lián)箱通常為29cm*23.5cm*19.5cm，格柵地板包括16根不銹鋼條（直徑2.5cm、中央間距為1.25cm）。此外，還有電壓計(jì)和聲強(qiáng)計(jì)，用來檢測刺激強(qiáng)度。
 
一、實(shí)驗(yàn)方法
分為訓(xùn)練和測試兩階段
（一）訓(xùn)練階段（**天）
1．調(diào)試儀器，以確保格柵地板有電流刺激，擴(kuò)音器有聲音刺激，并分別記錄電流強(qiáng)度和聲音強(qiáng)度（分貝）。
2．將大鼠放入條件恐懼箱2min（A相），記錄這*初2min內(nèi)動(dòng)物的凝滯（freezing）時(shí)間作基線。
3．接著加入卡嗒聲，80Db,30s(B相)。
4．緊接著再給予電擊，0.35mA，2s（C相），完成一輪訓(xùn)練。如需要多輪訓(xùn)練，則重復(fù)A、B、C三相訓(xùn)練即可。
5．記錄整個(gè)訓(xùn)練階段動(dòng)物凝滯時(shí)間（s），用以測量動(dòng)物的非條件恐懼（unconditioned fear）。
6．將大鼠移開操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液徹底清潔操作箱，以備進(jìn)行下一批動(dòng)物的訓(xùn)練。
（二）測試階段  在訓(xùn)練后的**天進(jìn)行，包括關(guān)聯(lián)（context）測試、變更關(guān)聯(lián)（alteredcontext）或條件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）測試以及條件刺激（conditioningstimulus，CS）測試。測試階段沒有電擊刺激。關(guān)聯(lián)測試和變更關(guān)聯(lián)測試中也沒有聽覺條件刺激，但每只動(dòng)物所用的操作箱應(yīng)與訓(xùn)練階段的相同。
1．關(guān)聯(lián)測試 將動(dòng)物放入箱內(nèi)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄動(dòng)物的凝滯行為。若用人工觀察，則觀察者（應(yīng)不知道動(dòng)物的處理或基因型）用靜聲秒表通過箱門上的貓眼（小窗口）觀察動(dòng)物的行為并計(jì)分：凝滯為1分，活動(dòng)（moving）為0分（也有只記錄凝滯時(shí)間）。每10秒觀察一次，共5min，這樣可記錄到30次（bout）可能的凝滯（即*大凝滯得分為30分）。用在這一階段記錄到的、動(dòng)物在同一操作箱內(nèi)的凝滯時(shí)間測量動(dòng)物的關(guān)聯(lián)條件恐懼（contextuallyconditioned fear）。此為關(guān)聯(lián)測試。觀察結(jié)束后將動(dòng)物放回籠內(nèi)，清潔操作箱，進(jìn)行下一只動(dòng)物的觀察。
2．變更關(guān)聯(lián)測試和聽覺條件刺激測試  關(guān)聯(lián)測試1h后進(jìn)行。操作如下：
（1）將計(jì)算機(jī)調(diào)至所需程序。
（2）操作箱進(jìn)行如下改造：1用平滑塑料板取代關(guān)聯(lián)條件箱內(nèi)的格柵地板；2在箱的對(duì)角線加一塊有色塑料板，這樣將長方體的操作箱變成三角體；3改變嗅覺暗示（olfactorycues）。例如，可在箱的一角放一個(gè)裝有一滴桔子汁或檸檬汁的杯子，或直接將一滴果汁涂于墻上。然后開始變更關(guān)聯(lián)和聽覺條件刺激實(shí)驗(yàn)。
（3）將動(dòng)物放入經(jīng)改造后的關(guān)聯(lián)箱（從關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)中的**只動(dòng)物開始）。
（4）啟動(dòng)預(yù)置的實(shí)驗(yàn)程序，每隔10秒記錄動(dòng)物的凝滯和非凝滯得分（分別為1和0分），共記錄3min，即18次可能的凝滯記錄（凝滯得分為18）。
（5）加入聽覺條件刺激30秒。重復(fù)上述記錄3分鐘。
（6）將動(dòng)物放回籠子，清潔操作箱，進(jìn)行下一只動(dòng)物的測試。
 
二、結(jié)果計(jì)算與分析
因?yàn)椴煌愋偷膶W(xué)習(xí)凝滯時(shí)間不同，所以*常使用百分計(jì)：
關(guān)聯(lián)=（關(guān)聯(lián)測試中的凝滯得分/30）*100%
變更關(guān)聯(lián)（條件刺激前）=（變更關(guān)聯(lián)中的凝滯得分/18）*100%
聽覺暗示（條件刺激）=（聽覺條件刺激中凝滯得分/18）*100%
對(duì)每一不同的凝滯測試計(jì)分進(jìn)行重復(fù)測量單因素方差分析（ANOVA），從此比較關(guān)聯(lián)和變更關(guān)聯(lián)或聽覺暗示之間的條件恐懼程度，并確定組間差異。一般而言，動(dòng)物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關(guān)聯(lián)測試的多。在變更關(guān)聯(lián)測試中，由于關(guān)聯(lián)條件箱已被改造得“面目全非”，訓(xùn)練時(shí)動(dòng)物獲得的對(duì)周圍環(huán)境的關(guān)聯(lián)幾乎不存在，因此，凝滯行為應(yīng)該*少。關(guān)聯(lián)與變更關(guān)聯(lián)差別很大，凝滯計(jì)分差別越大。
 如果動(dòng)物在**天的關(guān)聯(lián)測試和聽覺暗示測試中出現(xiàn)凝滯，而在變更關(guān)聯(lián)測試中不表現(xiàn)凝滯行為，則可認(rèn)定：動(dòng)物的感覺和運(yùn)動(dòng)功能均正常；能記住前**與厭惡刺激配對(duì)出現(xiàn)的暗示信號(hào)；能分辨前**不與厭惡刺激配對(duì)出現(xiàn)的暗示信號(hào)，說明動(dòng)物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項(xiàng)增強(qiáng)或減弱，提示調(diào)節(jié)記憶情感部分的神經(jīng)解剖、神經(jīng)遞質(zhì)和基因可能發(fā)生變化。
 
三、注意事項(xiàng)
1．動(dòng)物對(duì)電擊的反應(yīng)部分地取決于非條件刺激的電擊強(qiáng)度和痛#。當(dāng)動(dòng)物（尤其是基因改變的動(dòng)物，如轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠）不能學(xué)會(huì)關(guān)聯(lián)條件反射時(shí)，可能是電擊強(qiáng)度不夠或痛#偏高所致。對(duì)條件反應(yīng)程度與電擊強(qiáng)度進(jìn)行比較分析，可排除對(duì)電擊強(qiáng)度因素的疑慮；對(duì)刺激電流強(qiáng)度（0.1~0.7mA）與反應(yīng)作一“量-效曲線”，可評(píng)價(jià)動(dòng)物的痛#或?qū)﹄姄舻拿舾行?。此外，格柵地板若沾有?dòng)物的排泄物也可改變電刺激強(qiáng)度。因此，應(yīng)保持格柵地板的清潔與干燥。
2．由于老年動(dòng)物聽力減弱甚至喪失，對(duì)聽覺暗示可能反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)。此外，有些品系的小鼠，即使在成年早期，對(duì)高頻音刺激的反應(yīng)尤其減弱。因此，用這一模型測定老年動(dòng)物或某些品系的小鼠時(shí)應(yīng)特別謹(jǐn)慎，并避免用高頻音刺激。
3．要使動(dòng)物在關(guān)聯(lián)測試中表現(xiàn)凝滯行為，必須讓其在操作箱內(nèi)有適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。應(yīng)避免將動(dòng)物放入箱內(nèi)便立即給予電刺激，因?yàn)檫@樣動(dòng)物沒有時(shí)間在電擊與箱內(nèi)環(huán)境（關(guān)聯(lián)）之間形成聯(lián)系。
4．觀察者必須快速、準(zhǔn)確地判定動(dòng)物是否表現(xiàn)凝滯行為，而不應(yīng)在整個(gè)10s觀察期間死盯著動(dòng)物，以免動(dòng)物在這10s間隙活動(dòng)而導(dǎo)致計(jì)分不準(zhǔn)。不同觀察者應(yīng)用同一種方法計(jì)分，兩名觀察者計(jì)分之間的相關(guān)系數(shù)應(yīng)在0.98以上。同樣地，當(dāng)采用自動(dòng)計(jì)分系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)分時(shí)，應(yīng)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使之與人工方法計(jì)分相比，兩者的相關(guān)系數(shù)在0.98~1之間。
5．在本實(shí)驗(yàn)中，先測試關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)，再測試暗示條件反應(yīng)。在關(guān)聯(lián)測試中沒有聽覺暗示刺激，因此，動(dòng)物在暗示條件測試時(shí)對(duì)聽覺刺激的反應(yīng)有可能發(fā)生消退（extinction）。理論上，這種聽覺暗示反應(yīng)可能減弱。為消除這種實(shí)驗(yàn)偏差，將其中一半動(dòng)物先測試聽覺暗示反應(yīng)，一小時(shí)后再檢查關(guān)聯(lián)條件反應(yīng)。
6．實(shí)驗(yàn)分兩天進(jìn)行。訓(xùn)練和測試應(yīng)在每天的同一時(shí)間進(jìn)行。測試（凝滯計(jì)分）所花的時(shí)間比訓(xùn)練要長的多，因此，同一批訓(xùn)練的動(dòng)物不宜過多。
7．暗示和關(guān)聯(lián)兩種條件恐懼可表現(xiàn)出發(fā)育差異和基因差異。例如，年齡在18天的大鼠有聽覺條件恐懼，但極少有關(guān)聯(lián)條件恐懼；而到23天時(shí)，關(guān)聯(lián)和聽覺暗示條件恐懼都有。有些品系的小鼠（如DBA/2小鼠）只有很弱的關(guān)聯(lián)條件恐懼，但聽覺條件恐懼卻很好。
8．對(duì)有些基因型動(dòng)物，如果預(yù)先讓其短暫適應(yīng)關(guān)聯(lián)條件，關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)會(huì)得到改善。一般認(rèn)為這與海馬功能增強(qiáng)有關(guān)。這種適應(yīng)通常在訓(xùn)練前**進(jìn)行，而且時(shí)間很短（30~60s）。
9．暗示條件恐懼由側(cè)杏仁核調(diào)節(jié)，而關(guān)聯(lián)條件恐懼由杏仁核和海馬共同介導(dǎo)。毀損這些腦區(qū)可削弱或阻斷暗示與關(guān)聯(lián)恐懼條件反射。