神經系統(tǒng)染色技術

   神經病理學是組織病理學的一個重要組成部分，神經病理學技術是一門較特殊的病理技術。神經組織的結構和功能較為復雜的特殊，用常規(guī)方法處理，常得不到想要的東西，因此，要想獲取想要的東西，必須靠特殊的處理方法，才能將其充分地顯示出來。神經系統(tǒng)方面可顯示的物質較多，如尼氏小體、髓鞘、變性髓鞘、神經纖維和神經膠質細胞等等。這些都要靠特殊的銀浸染技術，才能顯示出來。下面將介紹幾種顯示上述物質的方法。
應用：神經系統(tǒng)染色應用于神經系統(tǒng)方面的各種**，如創(chuàng)傷、中毒、感染等引起神經系統(tǒng)方面的**，應作正常髓鞘和變性髓鞘的染色，以觀察髓鞘的變化及脫失情況，如脫髓鞘假瘤與彌漫的纖維星型細胞瘤鏡下有非典型性核分裂象和彌漫浸潤的單核細胞，充分發(fā)育的巨噬細胞缺少細胞將會誤診為膠質瘤，應作膠質細胞和神經纖維染色。
（一）蘇木素VG法染**神經
1、切片脫蠟至70%酒精
2、Weigert氏鐵蘇木素染10分鐘
3、自來水稍洗
4、如有必要，用1%鹽酸酒精分化
5、流水洗10-15分鐘
6、VG液染30分鐘
7、蒸餾水快洗
8、95%酒精分化
9、脫水、透明、封固
結果：細胞：灰黑色
          髓鞘：灰白色
          膠原：紅色
          肌纖維：黃色
          神經細胞細胞漿       黃色/琥珀色
          膠質纖維                       琥珀色
（二）神經細胞尼氏體染色
正常的神經細胞都含有一定數量的尼氏化，它們主要分布于神經細胞的漿中，形狀有大有小，如三角形，有的為橢圓形。這些物質能被大部分的藍色染料所染色，這些染料如焦油堅牢紫（Cresylfast violet）亞甲藍（methylene blue）甲苯胺藍（toluidineblue）硫董（thionin）等鈄其染為藍色。但是，當神經細胞受傷后，胞質內的尼氏體更可發(fā)生變化，嚴重的可消失。
焦油堅牢紫顯示尼氏體
焦油堅牢紫          1g
蒸餾水                       100ml
操作方法：
1、切片脫蠟至水
2、用焦油堅牢紫水溶液浸染20-30分鐘
3、水洗
4、用95%酒精分化
5、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠
結果：神經細胞單位：紫-藍色
          細胞核：紫-藍色
          尼氏體：紫-深藍色
注意：1、應用酒精分化切片，要迅速，防止過度分化，將切片上的顏色全部脫掉。
神經纖維染色
（三）改良的Marsland, Glees方法
（I）試劑的配制：
取無水乙醇  10ml，加入20%的硝酸銀水溶液，攪拌均勻后逐滴加入濃氨水，先是形成沉淀，后再逐滴加入氨水，讓早期形成的沉淀徹底溶解，然后再加入另外2-3滴氨水，即可使用。平時保存于4℃冰箱中。
（II）操作方法
1、切片撈于硅化載玻片上，于60℃烘烤2小時后備用。
2、切片脫蠟至水。
3、0.5%高猛酸鉀處理切片5分鐘。
4、水洗。
5、2%草酸處理切片2分鐘。
6、自來水洗，蒸餾水洗。
7、20%硝酸銀于37℃中作用60分鐘。
8、直接入10%福爾馬林溶液中處理，直至切片顏色轉為黃色到棕色為止，約10-20秒。
9、直接入上述氨銀液處理30秒。
10、直接入10%福爾馬林處理1-2分鐘。
11、自來水洗。
12、5%硫代硫酸鈉固定切片5分鐘。
13、脫水、透明、封固。
結果：
神經纖維：深棕色至黑色，背景淡棕色。
注意事項：
1、整個過程，應仔細操作，防止污染造成背景染色。
2、切片在9步驟后于鏡下檢查，如果浸染程度不夠，顏色較淺，可以重復8、9步。
（四）改良的Palmgren氏法染神經纖維
（I）試劑的配制：
a、酸性福爾馬林
   40%甲醛                 25ml
   蒸餾水                    75ml
   1%硝酸                  0.2ml
b、銀溶液
      銷酸銀                 15g
       硝酸鉀（Potassiumnitrate）       10g
      蒸餾水                10ml
       5%醋酸氨（amino acetic acid） 1ml
c、還原液
       焦 酚（Pyrogallol）        10g
      蒸餾水                450ml
      無水乙醇             550ml
      1%硝酸               2ml
       用前須靜置24小時
d、調色液
      氯化金                1g
      蒸餾水                200ml
      無水乙醇             550ml
      1%硝酸               2ml
e、加強劑
      50%乙醇                    100ml
      苯胺油（anilineoil）    2滴
f、固定液
       5%硫代硫酸鈉
（II）操作步驟
1、應用硅化載片裱片，于60℃烘烤切2小時。
2、切片脫蠟至水。
3、0.5%-1%高猛酸鉀水溶液處理切片5分鐘。
4、自來水洗。
5、2%草酸水溶液處理切片2分鐘。
6、自來水洗。
7、用酸性福爾馬林5-10處理分鐘。
8、蒸餾水洗換3次，每次2分鐘。
9、用銀液處理10分鐘（于37℃）
10、用預熱至45℃的還原液，摔去還原液，加入新的還原液，如此反復數次，至鏡下結果滿意為止。
11、50%乙醇苯胺油輕洗10秒鐘。
12、蒸餾水洗3次。
13、用氯水金調色。
14、自來水洗。
15、5%硫代硫酸鈉處理切片5分鐘。
16、脫水、透明、封固。
結果：神經纖維棕色至黑色。
（五）改良的Eager’s 法染變性軸索
（I）試劑的配制
a、氨銀液
1.5%硝酸銀         40ml
95%                    24ml
濃氨水                4ml
2.5%氫氧化鈉      3.6ml
b、還原液
無水乙醇             9ml
蒸餾水                81ml
1%檸檬酸            2.7ml
10%福爾馬林             2.7ml
（II）操作方法
1、組織用福爾馬林鹽固定
2、自來水洗，浸入蒸餾水中。
3、恒冷切片附貼于硅化的載玻片上或切片收集于水杯內。
4、切片或用玻璃鉤將切片移入2.5%硝酸雙氧鈾（uranyl nitrate）處理5分鐘。
5、蒸餾水輕洗后置入氨銀液中，直到切片變棕黃色為止，約10-15分鐘。
6、直接進入還原液至顏色沒有其它變化為止。約2-5分鐘。
7、蒸餾水洗。
8、5%硫代硫酸鈉處理切片5分鐘。
9、水洗，將切片裱于載片上。
10、脫水、透明、封固。
結果：變性神經纖維，棕色到黑色。
          正常的神經纖維，灰黃色。
（六）改良的Loyez氏法染神經髓鞘
（I）試劑的配制
a、碳酸鋰蘇木素液
碳酸鋰（Lithiumcarbonate）            1ml
飽和水溶液
10%成熟蘇木素無水乙醇液                    5ml
蒸餾水                                                   44ml
b、鉻酸氧化液
重鉻酸鉀                                         10g
濃濃酸                                     10ml
蒸餾水                                     90ml
c、Loyez氏分化液
四硼酸鈉                           1g
鐵***                           1.25g
蒸餾水                                     100ml
（II）操作方法
1、切片脫蠟至水
2、入以b液為原液酸成10%的氧化液氧化切片24小時。
3、水洗。
4、入4%的鐵明礬水溶液中媒染24小時。
5、蒸餾水洗。
6、入碳酸鋰蘇木素染液中浸染12-24小時。
7、自來水洗。
8、4%鐵明礬水溶液分化，至髓鞘顯示清晰為止。
9、自來水洗。
10、Loyez氏分化液分化切片約2分鐘。
11、水洗。
12、常規(guī)脫水、透明并封固。
結果：髓鞘及紅細胞顯示深藍色，軸索呈淡白色至淡黃色，其它組織也呈現(xiàn)淡黃色或灰黃色。
（III）注意事項
1、在常規(guī)活檢中，組織固定都是以福爾馬林為主，沒有特殊的固定液，如果作為科研標本，則可預先準備好特殊固定液固定組織，這樣效果會更好。
2、原法采用Laanna氏鉻化液即重鉻酸鉀9.5g，氯化鋅4.5g，蒸餾水100ml，未氧化切片，改良法采用5%鉻酸氧化液氧化切片，氧化力更強，效果更好。載片須用硅化載片，否則切片容易脫落。