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受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
日期：2024-12-07 12:14
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摘要：
α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
摘要:目的 探討α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(MLA) 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠在Morris 水迷宮中學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
方法 雄性昆明小鼠每天腹腔注射MLA (110、418μg/ g ) ,連續(xù)8d ,采用Morris 水迷宮,通過定位航行、空間探
索試驗(yàn)觀察分析小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果 小鼠腹腔注射MLA 418μg/ g 與其余三組相比,尋找平臺(tái)潛伏期
明顯延長(zhǎng)( P < 0101) ,在目標(biāo)象限游泳時(shí)間所占百分比也明顯降低( P < 0101) ,結(jié)論 腹腔注射MLA 418μg/ g
的小鼠有學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。
關(guān)鍵詞:α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑;Morris 水迷宮;學(xué)習(xí)記憶能力;小鼠
α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑是燕草屬植物飛燕草子(Delphinium spp1) 的提取物甲基牛扁亭(methyllycaconitine ,MLA) ,為一種植物**[1 - 2 ] 。近年來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明, MLA 通過對(duì)α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗, 導(dǎo)致動(dòng)物認(rèn)知功能障礙[3 - 4 ] 。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射法, 用Morris 水迷宮檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力, 擬建立一種模擬α7nACh 受體損傷的癡呆模型, 以進(jìn)一步為研究α7nACh 受體在阿爾茨海默病等退行性神經(jīng)系統(tǒng)**的作用機(jī)理和針對(duì)**α7nACh 受體損傷的**開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
111 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選用健康雄性3 個(gè)月齡昆明小白鼠(購(gòu)自寧夏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心) 85 只,隨機(jī)選取35 只用于確定*大逃逸潛伏期實(shí)驗(yàn),其余50 只,在正式開始實(shí)驗(yàn)的前**,小鼠依次在Morris 水迷宮中自由游泳2min ,選取游泳姿勢(shì)和速度符合要求的小鼠40 只,隨機(jī)分為4 組,每組各10 只。1) 正常對(duì)照組:小鼠自由進(jìn)食飲水,自然晝夜節(jié)律光照;2) 生理鹽水組:注射等量生理鹽水;3) 110μg/ g組:每天注射MLA 110μg/ g ,連續(xù)8d ;4) 418μg/ g 組:每天注射MLA 418μg/ g ,連續(xù)8d。
112 試劑和儀器 MLA:粉劑,購(gòu)自Sigma 公司。Morris 水迷宮及微機(jī)生物機(jī)能系統(tǒng),購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。
113 MLA 溶液制備及給藥劑量 臨用前將110μg/ g 和418μg/ g 的MLA 分別溶解于生理鹽水中,按011mL/ 10g 的
劑量連續(xù)注射8d。
114 Morris 水迷宮行為測(cè)定 水迷宮為圓形水池,池壁為乳白色,壁上標(biāo)有東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn),將水池等分為SW、MW、SE 及NE 四個(gè)象限,在SW象限正中放圓形透明平臺(tái),平臺(tái)頂?shù)陀谒?/span>1cm ,水溫(26 ±1) ℃,水中加入適量牛奶,至看不清水下平臺(tái)。迷宮正上萬(wàn)懸掛攝像機(jī)并連接計(jì)算機(jī)等記錄顯示系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜,迷宮外參照物(如門、窗、冰箱、電燈) 等保持不變。
11411 *大逃逸潛伏期的確定:選取的35 只小鼠,分上、下午兩個(gè)時(shí)段進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練時(shí)小鼠先自由游泳2min ,適應(yīng)環(huán)境后將小鼠面向池壁放入水中,記錄每次從入水點(diǎn)至找到平臺(tái)的*大時(shí)限。訓(xùn)練時(shí)操作者隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn),但在同一個(gè)訓(xùn)練時(shí)段內(nèi),每只小鼠的入水點(diǎn)相同。120s 內(nèi)找不到平臺(tái),將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上休息10s ,連續(xù)2d ,記錄找到平臺(tái)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,
選取90 %以上小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間,確定為*大逃逸潛伏期。
11412 注射MLA 動(dòng)物定位航行試驗(yàn)(place navigation) :將篩選并分組的小鼠,從第1 天起,按11411 方法訓(xùn)練5d ,記錄潛伏期及游泳速度,取后3d 的算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。注射MLA 后按同樣的方法繼續(xù)訓(xùn)練,連續(xù)8d ,取8d 的算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
11413 注射MLA 動(dòng)物空間搜索試驗(yàn)( spatial probe test) :在訓(xùn)練第5d 和注射MLA 8d 后,撤除水下平臺(tái),于平臺(tái)象限池壁中點(diǎn)為入水點(diǎn),記錄小鼠120s 內(nèi)搜尋平臺(tái)在各象限的游泳時(shí)間。
115 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
所有數(shù)據(jù)用(.x ±s) 表示,采用單因素方差分析(Oneway ANOVA) ,方差齊性時(shí),用LSD(Le Significant Difference)或Student Newman Keuls 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,方差不齊時(shí),用秩和檢驗(yàn),組間比較Kruskal Wallisttest。采用SPSS 1110 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果
211 *大潛伏期測(cè)定結(jié)果 35 只小鼠中,2 只原地打轉(zhuǎn),
·190 ·
寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)
Journal of Ningxia Medical College
第28 卷 3 期
2006 年6 月
不符合實(shí)驗(yàn)要求被剔除。33 只小鼠中有31 只經(jīng)2d (16 次)訓(xùn)練,能夠在第16 次訓(xùn)練后70s 以內(nèi)找到平臺(tái),超過總數(shù)
的90 % ,因此,確定*大潛伏期為70s。
212 注射MLA 動(dòng)物定位航行試驗(yàn)
21211 逃逸潛伏期:訓(xùn)練5d 后,各組與正常對(duì)照組逃逸潛伏期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0105) ; 注射MLA 后,
418μg/ g 組和正常對(duì)照組比較逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0101) ,其余各組與正常對(duì)照組比較逃逸潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0105) ,見表1。
21212 游泳速度:訓(xùn)練5d 后和注射MLA 后,實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組速度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0105) ,提示注射生理鹽水和MLA 后小鼠的運(yùn)動(dòng)能力沒有受到影響(表1) 。
表1 各組小鼠定位航行試驗(yàn)尋找隱匿平臺(tái)的平均潛伏期和平均速度
組別 潛伏期(s) 游泳速度(cm/ s)
訓(xùn)練5d 注射MLA 8d 訓(xùn)練5d 注射MLA 8d
正常對(duì)照 33.03 ±1.61 18.46 ±1.41 12.42 ±1.92 11.05 ±1.19
生理鹽水 32.68 ±4.99 17.11 ±1.45 11.12 ±1.29 11.84 ±4.03
MLA 110μg/ g 31.54 ±4.99 15.11 ±1.46 13.09 ±3.21 10.56 ±1.59
MLA 418μg/ g 29.65 ±5.34 47.95 ±9.313 11.21 ±1.35 10.13 ±0.59
與對(duì)照組潛伏期比較3 P < 0101
213 注射MLA 動(dòng)物空間搜索試驗(yàn) 訓(xùn)練至第5d ,各組與正常對(duì)照組平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0105) ;注射MLA 后,418μg/ g 組和正常對(duì)照組平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0101) ,其余各組與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0105) ,見表2。
表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)在目標(biāo)
象限所占時(shí)間百分比
組別 平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比( %)
訓(xùn)練5d 注射MLA 8d
正常對(duì)照 45.12 47.61
生理鹽水 49.52 45.33
MLA 110μg/ g 41.87 45.62
MLA 418μg/ g 41.23 29.98*
與對(duì)照組比較*P < 0101
3 討論
隨著學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的不斷深入,以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類**方法的需要,客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶水平已經(jīng)成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常重要的研究?jī)?nèi)容。Morris 水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris 于20 世紀(jì)80 年代初設(shè)計(jì)的,主要應(yīng)用在學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制探討和神經(jīng)藥理(包括中藥藥理) 的研究[5 ] 。但Morris 使用這一迷宮測(cè)試方法所針對(duì)的對(duì)象是大鼠,經(jīng)過查閱資料發(fā)現(xiàn)亦有將之應(yīng)用于小鼠的,但訓(xùn)練方法有所不同[6 - 8 ] ,在我們的測(cè)試中,訓(xùn)練為5 d ,分上、下午兩個(gè)時(shí)段,每段訓(xùn)練4 次,實(shí)驗(yàn)至第3 天基本穩(wěn)定,提示Morris 水迷宮也適用于小鼠的記憶行為測(cè)試。測(cè)試35 只小鼠,將*大潛伏期確定為70s ,在本實(shí)驗(yàn)中是比較合適的,既排除了因訓(xùn)練時(shí)間不同,而造成小鼠記憶能力的差異,也節(jié)省了時(shí)間,確保實(shí)驗(yàn)的完成。但由于訓(xùn)練的工作量大,工作人員少,測(cè)試的樣本量較少,對(duì)于更準(zhǔn)確地確定小鼠的*大潛伏期合適范圍還需要進(jìn)一步的研究。Morris 水迷宮的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為復(fù)雜,其統(tǒng)計(jì)分析難度也較大,尤其是小鼠在定位航行中所測(cè)得的逃避潛伏期如何進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析既往存在的問題較多。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)正常對(duì)照組的小鼠,通過5d 的訓(xùn)練期和8d 測(cè)試期,逃逸潛伏期逐漸減少,但在訓(xùn)練2d 后基本趨于穩(wěn)定,因此,取后3d 的平均逃避潛伏期作為平均訓(xùn)練潛伏期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。a7nACh 受體在阿爾茨海默病(AD) 的早期就有缺失,認(rèn)為是AD 的早期癥狀,因此人們開始試圖以a7nACh 受體為靶點(diǎn),研究其結(jié)構(gòu)、分布和功能與AD 的關(guān)系。但由于神經(jīng)元煙堿受體( nAChR) 亞型之間差別很小,數(shù)量又很多,就α7nACh 受體亞型也不僅有種屬差異,而且隨年齡的變化而有改變,因此,要尋找α7nACh 受體亞型特異性拮抗劑或激動(dòng)劑是非常艱難的,雖然近年來在合成競(jìng)爭(zhēng)性特異性激動(dòng)劑方面取得一些進(jìn)展[9 ] ,但具有高親和性特異性高的拮抗劑還是很少的,目前僅有a -bungarotoxin[10 ]和a - conotoxinI2mI and methyllycaconitine(MLA) [11 ] 。MLA 對(duì)哺乳類動(dòng)物的神經(jīng)型a7nACh 受體的親和性比其它煙堿受體都要高。本實(shí)驗(yàn)中腹腔注射MLA 110 、418μg/ g 后,發(fā)現(xiàn)MLA 對(duì)小鼠的記憶有損害,且有劑量依賴性,提示可以通過選擇適當(dāng)劑量的MLA ,擬建立一種模擬a7nACh 受體靶點(diǎn)損傷的動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究α7nACh受體在AD 等神經(jīng)系統(tǒng)退行性**的作用機(jī)理和針對(duì)**α7nACh 受體損傷的**開發(fā)提供依據(jù)。
α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響α7nACh 受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
