【摘要 】 目的 觀察人骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (BMSCs)移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)的保護(hù)作
探討 BMSCs腦移植** H I BD的可行性。方法 36只新生大鼠隨機(jī)分為對照組、 H I BD組和移植組
n = 12)。H I BD組和移植組大鼠 7日齡時(shí)結(jié)扎左側(cè)頸總動脈后吸入 8% 氧氣 2 h制成 H I BD模型。對
僅分離左頸總動脈 ,不予結(jié)扎和缺氧。分離培養(yǎng)人 BMSCs,損傷后 3 d將 BMSCs立體定位腦移植到移
大鼠左側(cè)感覺運(yùn)動皮層。3～4周齡時(shí) ,觀察大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變 ,并用**熒光檢測移植細(xì)胞
存活情況。結(jié)果 缺氧缺血后 3周 , H I BD組海馬 DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目較正常組減少 [海
DG區(qū): (39 . 2 ± 5 . 6) 個(gè) vs (51 . 1 ± 3 . 9)個(gè) , P < 0 . 001;皮層: (12 . 3 ± 3 . 0)個(gè) vs (17 . 8 ± 3 . 0)個(gè) , P
01 ]。BMSCs移植后海馬 DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目 [海馬: ( 44 . 9 ±3 . 1)個(gè) ,皮層: ( 17 . 5
)個(gè) ]較 H I BD組增加 ( P < 0 . 01)。與對照組比較 , H I BD組在 T迷宮、 感覺運(yùn)動功能測試中表現(xiàn)出明顯
不足。BMSCs腦移植組各項(xiàng)行為學(xué)測試成績較 H I BD組均有明顯改善。**熒光顯示移植后 3周 ,BM
在腦內(nèi)存活。結(jié)論 BMSCs腦移植可以改善新生鼠 H I BD。
【關(guān)鍵詞 】 缺氧缺血; 腦; 骨髓基質(zhì)細(xì)胞; 移植; 大鼠
Effects of human bone marrow stroma l cells i n tracerebra l tran spl an ta ti on on the i mprovemen t of hypox i c2
ischem i c bra i n damage i n ra ts ZHONG Le, YANG Yu2jia, J I A Yan2jie, et al . Depart m ent of Pediatrics, X ian2
gya Hospital , Central South Univer sity, Changsha 410008, China
【Abstract】 Objecti ve To investigate the p r otective effect of bone marrow str omal cells (BMSCs) intrace2
rebral trans p lantati on on ratswith hypoxic2ischemic brain damage (H I BD) . Methods Thirty2six 72 days2 old S D
rats were randomly divided int o the Control gr oup, H I BD group and Transp lanted group ( n = 12) . Rats in the lat2
ter t wo gr oup swere subjected t o ligati on of the left car otid artery, foll owed by 2 hours of hypoxia . Contr ol ratswere
sham operated without ligati on of the artery and subsequent hypoxia . BMSCs were obtained from healthy human
ribs . Rats in the Trans p lanted group received BMSCs intracerebral trans p lantati on in the left sens ori mot or cortex at
the 3
rd
day post2 damage . The neur op rotective effect of trans p lantati on was evaluated by hist ol ogical examinati on and
behavi oral tests, which concluded the T2 maze test and sens ori mot or tests, at 3～4 weeks postnatal . Transp lanted
BMSCs were identified by i mmunofluoresence . Results Hypoxia2ischemia induced neurons l ost in DG area
(33 . 92 ± 5 . 6) vs (51 . 1 ± 3 . 9) , P < 0 . 001 ] and cortex [ (12 . 3 ± 3 . 0) vs (17 . 8 ± 3 . 0) , P < 0 . 001 ] was sig2
nificantly less in BMSCs transp lanted rats [ (44 . 9 ± 3 . 1) , P = 0 . 003; (17 . 5 ± 3 . 1) , P < 0 . 001 ] than in H I BD
rats . H I BD rats show much insufficiency in the behavi or tests, as compared with the contr ols . While in most be2
havi or tests the trans p lanted rats were significantly better than the H I BD rats . With i mmunofluoresence examina2
ti on, BMSCs could be found in the brains . Conclusi on I ntracerebralBMSCs trans p lantati on could i mp r ove H I BD
in rats .
【Key words】 Hypoxia2ischemia brain; Bone marr ow stromal cell ; Cell trans p lantati on; Rat
盡管圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)取得了很大進(jìn)展 ,缺氧缺血性腦病
(H IE)的發(fā)病率并沒有明顯下降 ,它仍是腦癱、 精神發(fā)
育遲滯、 學(xué)習(xí)障礙和癲癇的常見原因[ 1 ]
。雖然目前
H IE的機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展 ,但是臨床仍缺少特
異性**手段 ,以對癥支持綜合**為主。近來發(fā)現(xiàn)
骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (BMSCs)移植可以**成年鼠大腦中
動脈阻斷 (MCAO)模型缺血性腦損傷 , 但 BMSCs移植
**新生鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)是否也有效尚
缺乏相關(guān)的研究。新生動物 H I BD屬于彌漫性腦損
傷 ,與成年大鼠 MCAO模型易損部位以及發(fā)病和修復(fù)機(jī)制均有不同。因此我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MSCs
移植對新生大鼠 H I BD有無保護(hù)作用。
材料與方法
一、 人 BMSCs的原代培養(yǎng)及傳代
取健康胸外傷病人肋骨 (由胸外科提供 ) ,無菌狀
態(tài)下 ,用 DMEM完全培養(yǎng)基仔細(xì)沖洗骨髓腔 ,將沖洗
下的組織反復(fù)通過 1ml的注射器 ,制備成細(xì)胞懸液 ,
鏡下計(jì)數(shù) ,稀釋后以 1 ×10
7
接種于 75 cm2
培養(yǎng)瓶中。
24 h后換液 ,去除未貼壁的細(xì)胞。待貼壁細(xì)胞 90%融
合后 , 0 . 25%胰蛋白酶消化傳代。
二、 動物分組及缺氧缺血腦損傷模型的制備
36只新生清潔級 Sp rague2 Dawley大鼠 (由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供 ) ,雌雄不拘 ,體質(zhì)量在 12 g以
上 ,隨機(jī)分為對照組 , H I BD組和 BMSCs移植組 ,每組
12只。按照 Rice方法[ 4 ]
制作 H I BD模型。簡述為:分
離、 結(jié)扎、 并剪斷左頸總動脈 ,而后將之放入 8%的氮
氧混合氣的 36℃ 恒溫箱 2 h。12只對照組大鼠于 7日
齡行假手術(shù) ,僅予以分離左頸總動脈 ,不予結(jié)扎和缺
氧。移植組大鼠在缺氧缺血后 3 d進(jìn)行移植。
三、 間接**熒光
正常山羊血清室溫封閉 30min;加入一抗 4℃冰
箱過夜; PBS洗 5min × 3次;加入二抗室溫 1 h; PBS洗
5min × 3次;熒光顯微鏡下觀察。BMSCs的鑒定所用
一抗分別為小鼠抗 CD11b單抗 (1: 200, Santa Cruz) ;
小鼠抗 CD90 . 1單抗 ( 1: 200, Chemicon) ;兔抗 CD34
多抗 ( 1: 200, Santa Cruz) ;兔抗 CD59多抗 ( 1: 200,
Santa Cruz) ;小鼠抗纖粘連蛋白單抗 ( 1: 200, Santa
Cruz)。體內(nèi)外人 BMSCs的識別所用一抗為小鼠抗人
核單抗 (1: 30, MAB1281, Chemicon)。二抗為山羊抗
小鼠 I gG2 Cy3 (1: 100, Sigma) ,或山羊抗兔 I gG2 Cy3 (1:
100, Sigma)。
四、 BMSCs移植
取第 5代 BMSCs,洗滌離心后 ,調(diào)整活細(xì)胞密度為
5 × 10
7
/ ml。應(yīng)用立體定位儀 ( ST OELTI NG T L 2型 ,
美國 ) ,以左側(cè)感覺運(yùn)動皮層區(qū) (前囟前 0 . 3mm;前囟
左 2mm,深 1 . 5mm)為移植點(diǎn) ,注入 2μl BMSCs細(xì)胞
懸液 (5 × 10
4
/μl)。
五、 行為學(xué)測試[ 2 ]
1 . T迷宮測試[ 2 ]
( T maze test) :每只動物每日測
試 5次 ,每次間隔 15min,連續(xù) 4 d,共 20次。
2 .感覺運(yùn)動功能測試: 34日齡時(shí)進(jìn)行測試[ 3 ]
。包
括足錯(cuò)誤 ,肢體放置和試驗(yàn)具體方法見鐘樂[ 2 ]
和王
霞[ 3 ]
報(bào)道。
六、 組織切片制備
28日齡時(shí)進(jìn)行。10%水合氯醛麻醉 ,打開胸腔 ,
左心室穿刺 ,注入冷**生理鹽水 ,同時(shí)剪開右心耳讓
血流出 ,直至流出的液體變清為止 ,再與以 4%多聚甲
醛 /0 . 1MPBS灌注固定。斷頭取腦 ,置于 4%多聚甲
醛 /0 . 1MPBS溶液中固定 72 h以上。常規(guī)脫水及石蠟
包埋 ,切片厚 3μm。
七、 尼氏染色
取前囟和前囟后 3mm部位切片 , 0 . 1%甲苯胺蘭
60℃ 溫染 1min,水洗 , 70%、 80%酒精脫水 , 95%酒精
鏡下分化 ,直至細(xì)胞核和背景為淡藍(lán)或無色, 100%酒
精脫水 ,松節(jié)油透明 ,封片。光鏡下 ( × 200)計(jì)數(shù)皮層
和海馬 DG區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)目。
八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
全部資料用 SPSS11 . 0軟件包統(tǒng)計(jì)軟件處理。
結(jié) 果
一、 BMSCs的原代培養(yǎng)與傳代
剛接種時(shí) ,培養(yǎng)瓶中有大量的懸浮細(xì)胞。24 h換
液后可見部分細(xì)胞貼壁 ,仍為圓形。骨髓中的造血干
細(xì)胞不會貼壁 ,可在換液中逐漸除去。貼壁的細(xì)胞漸
增多 ,為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 ,胞體細(xì)長呈纖維狀 ,細(xì)胞
核較大 ,為橢圓形。7 d時(shí) ,細(xì)胞呈簇狀生長 ,分布不
均 ,顯示出集落生長趨勢。至 2周時(shí) ,細(xì)胞融合成單
層。傳代細(xì)胞 24 h內(nèi)完全貼壁 , 3 d進(jìn)入對數(shù)生長期 ,
7～10 d后即可融合。
二、 **熒光
培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá) CD59, CD90 . 1和纖粘連蛋白等
抗原 ,不表達(dá) CD11b, CD34等白細(xì)胞和造血干細(xì)胞抗
原 ,說明其為 BMSCs。小鼠抗人核抗體 (MAB1281)能
識別來源于人的細(xì)胞核 ,不識別其他物種的細(xì)胞核 ,結(jié)
果顯示人 BMSCs表達(dá)人核抗體 ,而對照的大鼠 BMSCs
不表達(dá)人核抗體。
三、 BMSCs移植對缺氧缺血后神經(jīng)元損傷的影響
缺氧缺血導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷 ,使 H I BD組海馬 DG
區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元較正常組減少 [ ( 39 . 2 ±
5 . 6)個(gè) vs (51 . 1 ± 3 . 9)個(gè) , P < 0 . 001; (12 . 3 ± 3 . 0)個(gè)
vs (17 . 8 ±3 . 0)個(gè) , P < 0 . 001 ]。BMSCs移植后海馬
DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目較 H I BD組增加
[ (44 . 9 ±3 . 1)個(gè) , P = 0 . 003; ( 17 . 5 ±3 . 1 )個(gè), P <
0 . 001 ]。
四、 BMSCs移植對缺氧缺血后行為學(xué)損傷的影響
1 . T迷宮測試:各組在連續(xù) 4 d的試驗(yàn)中 ,隨著天
數(shù)的增加 ,對照組和移植組正確率逐漸增高 ,而 H I BD
組正確率上升不明顯 ,說明學(xué)習(xí)能力較差。在第 4天
時(shí)各組間正確率的差異有顯著性意義 ( F = 24 . 772, P
< 0 . 001) , H I BD組的正確率較對照組和移植組顯著降
低 ( P < 0 . 001, P = 0 . 004) ,移植組的正確率低于對照
組 ( P = 0 . 007)。見表 1。
表 1 各組 T迷宮測試正確率 ( n = 12, % , x ±s )
組別 1 d 2 d 3 d 4 d
對照組 61 . 7 ± 18 . 0 81 . 7 ± 13 . 4 86 . 7 ± 15 . 6 98 . 3 ± 5 . 7
H I BD組 58 . 3 ± 27 . 8 63 . 3 ± 36 . 0 68 . 3 ± 26 . 2 66 . 7 ± 15 . 63 3
移植組 60 . 0 ± 19 . 1 70 . 0 ± 18 . 1 73 . 3 ± 21 . 5 86 . 7 ± 17 . 13 △
F值 0 . 077 1 . 719 2 . 325 24 . 772
P值 0 . 930 0 . 190 0 . 110 0 . 000
注:與對照組比較 3
P? 0. 05,
3 3
P? 0. 01;與 H I BD組比較 △ P?
0. 01
2 .感覺運(yùn)動測試:足錯(cuò)誤:各組的足錯(cuò)誤右左差值
差異有顯著意義 ( F = 15 . 675, P < 0 . 001) , H I BD組右
左差值 (3 . 00 ± 1 . 04)較對照組 (0 . 67 ± 1 . 30)和移植
組 (0 . 33 ± 1 . 44)高 (均 P < 0 . 001) ,說明該組大鼠左
右運(yùn)動不對稱 ,右側(cè)差于左側(cè)。移植組與對照組比較
差異沒有顯著意義 ( P = 0 . 525)。
姿勢反射:各組大鼠得分情況見表 2。對照組均
為 0分 ,而 H I BD組僅 8例為 0分 ,兩組差異有顯著意
義 ( Z = - 2 . 145, P = 0 . 032) ;移植組 11例為 0分 ,較
· 003 · 中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué) 2006年 4月第 15卷第 4期　Chin J of BehavioralMed Sci,Ap ril 2006,Vol 15,No . 4
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net表 2 各組大鼠姿勢反射不同得分情況比較 (例數(shù) )
組別 鼠數(shù) 0分 1分 2分
對照組 12 12 0 0
H I BD組3
12 8 4 0
移植組 12 11 1 0
注:與對照組比較,
3
P? 0. 05
H I BD組增多 ,但兩組間差異無顯著性 ( Z = - 1 . 476,
P = 0 . 140)。
肢體放置:對照組與移植組大鼠的得分差值絕大
多數(shù)為 0分 (百分率分別為 91 . 67%和 100% ) ,而
H I BD組的得分差為 1～4分 (1～4分得分百分率分別
為 16 . 67%、 33 . 33%、 16 . 67%、 33 . 33% ) ,與對照組和
移植組比較差異有顯著性 ( Z = - 4 . 349, P < 0 . 001; Z
= - 4 . 4, P < 0 . 001)。
五、 移植后 BMSCs的檢測
單克隆抗人核抗體 (MAB1281)能識別移植到大
鼠腦內(nèi)的人 BMSCs。在移植部位可見大量陽性細(xì)胞
延針道分布 ,大量分布于移植點(diǎn)周圍 ,向腦實(shí)質(zhì)內(nèi)擴(kuò)
散 ,隨著移植點(diǎn)距離的增大陽性細(xì)胞逐漸減少。
討 論
7日齡的大鼠處于腦發(fā)育的高峰期 ,相當(dāng)于人類
的 32～34周胎齡或新生兒期 ,此時(shí)缺氧缺血造成的腦
損傷與圍產(chǎn)期窒息造成的足月兒腦損傷相似[ 4 ]
。目
前動物實(shí)驗(yàn)多采用短期內(nèi)病理損傷情況和生物化學(xué)改
變作為判斷 H I BD療效的指標(biāo)。但在**神經(jīng)系統(tǒng) ,
特別是未成熟腦中 ,組織的修復(fù)和代償機(jī)制會影響遠(yuǎn)
期的損傷情況和功能恢復(fù) ,因此遠(yuǎn)期的組織學(xué)和行為
學(xué)檢查更有意義[ 5 ]
。
本研究顯示 ,在缺氧缺血 4周后 , H I BD大鼠 DG
區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元分別為對照組的 75 . 8%
和 68 . 8% ,而 BMSCs移植對于缺氧缺血造成的神經(jīng)元
損傷有保護(hù)作用 , DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)的神經(jīng)元
數(shù)目恢復(fù)至對照組的 87 . 1%和 98 . 9%。移植后神經(jīng)
元數(shù)目的增加可能與以下三個(gè)機(jī)制有關(guān):移植細(xì)胞直
接分化為神經(jīng)元、 移植促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化為神
經(jīng)元以及 BMSCs分泌的干細(xì)胞因子、 神經(jīng)生長因子、
腦源性神經(jīng)生長因子、 堿性成纖維生長因子等因子具
有神經(jīng)元保護(hù)作用[ 62 8 ]
。
行為學(xué)檢查也顯示 , H I BD大鼠在損傷 3周后 T迷
宮測試和感覺運(yùn)動測試成績會顯著低于對照組。T迷
宮測試主要用于學(xué)習(xí)記憶和空間能力考察。邊緣系統(tǒng)
中的海馬與學(xué)習(xí)和記憶有密切的關(guān)系[ 9, 10 ]
。除了海
馬外 ,大腦皮質(zhì)、 紋狀體、 杏仁核和小腦也與學(xué)習(xí)記憶
有關(guān)[ 11 ]
。缺氧缺血損傷皮層、 丘腦和紋狀體 ,會導(dǎo)致
大鼠的感覺運(yùn)動功能異常[ 12 ]
。在感覺運(yùn)動測試中 ,由
于存在個(gè)體差異 , H I BD大鼠不一定所有的測試均異
常;而對照鼠也可能有某項(xiàng)測試的異常 ,因此本研究采
用了 3項(xiàng)感覺運(yùn)動測試以提高檢查的準(zhǔn)確性和特異性。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ,將人 BMSCs移植**新生大鼠 H I BD,
可以顯著改善行為學(xué)損傷 ,這與 BMSCs移植**成年
鼠腦缺血的結(jié)果相似[ 6, 13 ]
。BMSCs移植到感覺運(yùn)動皮
層可使感覺運(yùn)動各項(xiàng)測試成績基本恢復(fù)正常水平 ,對
T迷宮測試的成績也有改善。由于實(shí)驗(yàn)中未觀察到能
遷移至海馬部位的 BMSCs,考慮移植對學(xué)習(xí)記憶和空
間能力的改善可能與以下兩點(diǎn)機(jī)制有關(guān):其一 ,除了海
馬外 ,皮層和紋狀體也與學(xué)習(xí)記憶有關(guān) ,移植的細(xì)胞對
皮層以及鄰近的紋狀體起了功能重建作用;其二 ,
BMSCs 能分泌干細(xì)胞因子、 神經(jīng)生長因子、 腦源性神經(jīng)
生長因子、 堿性成纖維生長因子等多種細(xì)胞因子[ 62 8 ]
,
這些細(xì)胞因子對海馬可能起到了保護(hù)作用。
雖然實(shí)驗(yàn)中采用的是異種移植 ,沒有進(jìn)行**抑
制** ,移植物卻存活良好,這可能與 BMSCs不表達(dá)
主要組織相容性抗原和白細(xì)胞分化簇 (CD) 40、 CD80、
CD86,并能分泌可溶性介質(zhì)下調(diào)**反應(yīng)有關(guān)[ 6 ]
。如
果 BMSCs移植日后應(yīng)用于臨床 ,將能采集患者自體細(xì)
胞進(jìn)行移植 ,無需考慮**排斥問題。本實(shí)驗(yàn)證明了
BMSCs移植**新生大鼠 H I BD,對組織學(xué)和行為學(xué)
均有改善作用。因此 , BMSCs作為細(xì)胞移植物 ,在新
生兒 H IE的**上可能有廣闊的應(yīng)用前景。
參 考 文 獻(xiàn)
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(收稿日期: 2005 - 08 - 25)
(本文編輯:馮學(xué)泉 )