基因敲除(gene knockout ) 是 80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術(shù), 是制備轉(zhuǎn)基因動物的重要技術(shù)之一。利用該技術(shù)可以培育先天缺陷某一特定基因的動物, 以此研究該特定基因的生理功能或在**發(fā)**展中的意義。近年來基因敲除小鼠在**依賴性研究中也得到廣泛的應(yīng)用。在傳統(tǒng)的**依賴性研究中, 往往選取特異性的受體配體來研究該受體在依賴性中的作用, 但這種特異性往往是相對的 ,劑量改變就可能影響其它受體的功能,所以難以真正確定該受體的作用。而基因敲除技術(shù)在這方面具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn), 因?yàn)槔没蚯贸夹g(shù)可以選擇性敲除某一特定受體基因, 獲得先天缺陷該受體基因的小鼠,通過比較基因缺失動物(本文簡稱 KO型) 和野生型動物(本文簡稱 WT 型) 在依賴性模型上的行為差別 , 可以準(zhǔn)確判斷該受體所發(fā)揮的作用?？梢哉f, 基因敲除技術(shù)的發(fā)展為**依賴性研究帶來了一場新的**。本文綜述了近年來這一方面的研究進(jìn)展。

1 基因敲除技術(shù)簡介[1 ]

基因敲除是通過人為干預(yù)達(dá)到抑制或滅活目的基因表達(dá)的分子生物學(xué)技術(shù)。它采用同源重組方法(homologous recombinat ion)用突變的基因刪除(取代)相應(yīng)的正常基因, 或用正?；蚯贸鄳?yīng)的突變基因, 從表達(dá)水平或轉(zhuǎn)基因動物的表現(xiàn)型來研究正?；虻墓δ芎屯蛔儾课坏淖饔?。利用基因打靶 (gene target ing) 技術(shù)獲得基因敲除動物是其中的一種方法, 其步驟是使胚胎干細(xì)胞內(nèi)的目的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變 (基因打靶) , 將打靶后已定點(diǎn)突變的胚胎干細(xì)胞注射到宿主胚泡中, 再將胚胎植入假孕母體的**內(nèi),使其發(fā)育成目的基因缺陷 (突變) 的雜合的種系嵌合體, 將其自交后再篩選出目的基因缺陷型的純合子即基因敲除動物。通過分析基因敲除動物體內(nèi)單基因缺陷所產(chǎn)生的表型異常來研究基因調(diào)控和功能, 建立**的動物模型以及進(jìn)行基因**等。

2 敲除**受體基因

**受體是**類物質(zhì)直接作用的受體, 不僅在介導(dǎo)**類鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用, 而且也與精神活**物的依賴性有關(guān)。**受體分為μ、δ和κ等幾種亞型,目前 ,已經(jīng)培育了μ、κ和δ受體缺陷的小鼠 ,為研究μ、κ和δ受體在**依賴性中的作用提供了很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/font>

2. 1μ**受體

μ受體基因敲除小鼠, 其后代符合孟德爾遺傳規(guī)律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %雜合子, 24. 8 %的純合子 , 說明突變的μ受體基因缺陷小鼠沒有發(fā)生宮內(nèi)和出生后死亡。這種小鼠的生長、發(fā)育、生殖和活動周期等與正常小鼠無明顯差異。放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示 ,μ受體 KO 小鼠沒有任何μ受體存在,但δ和κ受體的數(shù)量和分布未受影響[2 ]。

**是選擇性較高的μ**受體激動劑, 其對WT小鼠有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用, 但在μ受體 KO小鼠不出現(xiàn)鎮(zhèn)痛。在浸尾、甩尾和熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中,對μ受體KO小鼠皮下注射**達(dá)到 50 mg·kg- 1,鞘內(nèi)或腦室內(nèi)注射**劑量達(dá)到WT小鼠鎮(zhèn)痛ED50的15倍都不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。表明μ**受體基因編碼的受體對介導(dǎo)**在痛通路中的作用是必須的。在同樣實(shí)驗(yàn)條件下,**在κ、δ受體KO小鼠仍有鎮(zhèn)痛作用, 證明了κ和δ受體不參與介導(dǎo)**鎮(zhèn)痛。用條件性位置偏愛方法評價**的欣快效應(yīng)證明**(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠產(chǎn)生 CPP 效應(yīng) ,而在μ受體 KO 小鼠不能引起 CPP 效應(yīng)。慢**物給藥使 WT 小鼠形成身體依賴性, 納洛酮誘發(fā)其出現(xiàn)戒斷癥狀, 同樣處理μ受體 KO 小鼠不出現(xiàn)戒斷癥狀。重復(fù)**給藥使 WT 小鼠腦內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的活性上調(diào), 而在μ受體 KO 小鼠腦不產(chǎn)生腺苷環(huán)化酶活性上調(diào) [3 ], 說明**產(chǎn)生的精神依賴性和身體依賴性是μ**受體介導(dǎo)的, μ**受體基因編碼的產(chǎn)物是**藥理效應(yīng)的既定的分子靶位。

2. 2κ**受體

κ受體 KO 小鼠的自發(fā)活動與 WT 小鼠無差別。κ受體激動劑 U50488H 在κ受體 KO 小鼠不引起鎮(zhèn)痛作用 , 也不形成條件性位置厭惡效應(yīng), 而在WT 小鼠出現(xiàn),表明κ受體在κ激動劑作用中的重要性。**在κ受體 KO 小鼠的鎮(zhèn)痛作用和條件性位置偏愛效應(yīng)與 WT 小鼠無差別, 但**的戒斷癥狀則明顯弱于 WT 小鼠, 說明κ受體不參與**的鎮(zhèn)痛和獎賞效應(yīng), 但參與調(diào)節(jié)**的身體依賴性[4 ]。

2. 3δ**受體

在δ**受體基因敲除小鼠,δ受體激動劑DPDPE 的鎮(zhèn)痛作用在脊髓水平明顯減弱, 但在脊髓上水平的鎮(zhèn)痛作用與野生型無差異, 說明δ受體在不同部位的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中所起的作用不一樣。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)δ受體敲除小鼠不對**的鎮(zhèn)痛作用產(chǎn)生耐受性 [5 ], 但δ受體敲除小鼠在依賴性中的作用還有待于進(jìn)一步研究。

3 敲除多巴胺受體或多巴胺遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因

多巴胺 (DA) 系統(tǒng)是**精神依賴性的神經(jīng)基礎(chǔ), 中腦邊緣DA 系統(tǒng)是“獎賞系統(tǒng)”中*重要的一環(huán)。DA 受體亞型有兩類: D1 樣 (D1 和D5 受體) 和D2樣(D2、 D3 和D4 受體) ,不同的DA 受體亞型在**獎賞中發(fā)揮的作用也不相同。利用基因敲除技術(shù)已經(jīng)培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受體缺陷的實(shí)驗(yàn)小鼠,為探討DA 受體在**獎賞效應(yīng)中的作用提供了依據(jù)。

3. 1 D1 受體

D1 受體 KO 小鼠基礎(chǔ)性活動多于 WT 小鼠。***能使 WT 小鼠活動增加,而不能使D1 受體 KO小鼠活動增加, 但***的位置偏愛效應(yīng)在兩種小鼠都出現(xiàn)[6 ]。***反復(fù)給藥的行為敏化現(xiàn)象在D1 受體 KO 小鼠低于 WT 小鼠; ***在D1受體KO小鼠和WT小鼠都形成自身給藥, 但 KO 小鼠的陽性反應(yīng)率低于 WT 小鼠[7 ]。這些實(shí)驗(yàn)說明D1 受體激活可能是***、***運(yùn)動增強(qiáng)效應(yīng)所必需的,而不是獎賞效應(yīng)所必需的。但這與正常 WT 型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致, 因?yàn)樵谡Ｊ?/font>, D1 受體拮抗劑可抑制**的自身給藥和偏愛效應(yīng)。造成這種不一致的原因可能與受體拮抗劑的特異性有關(guān), 也可能與基因敲除小鼠的遺傳異常有關(guān)。

3. 2 D2 受體

在**類誘導(dǎo)的運(yùn)動增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中, D2 受體KO 小鼠對內(nèi)源性和外源性**類物質(zhì)誘導(dǎo)的運(yùn)動增強(qiáng)效應(yīng)與 WT 小鼠無顯著性差異, 表明 D2 受體缺失未影響**誘導(dǎo)的運(yùn)動增強(qiáng)效應(yīng)。在**身體依賴性實(shí)驗(yàn)中,D2 受體 KO 小鼠和 WT 小鼠的戒斷癥狀沒有明顯差別,說明 D2 受體在**身體依賴性中不起重要作用。在位置偏愛實(shí)驗(yàn)中, D2 受體 KO小鼠不對**形成偏愛效應(yīng), 但對食物形成偏愛效應(yīng) ,說明 D2 受體在精神依賴性中起重要作用; 并且**獎賞和自然獎賞效應(yīng)的機(jī)制可能不同[8 ]。

3. 3 D3 受體

與WT小鼠相比,D3受體KO小鼠的基礎(chǔ)活動增加 ,低劑量的***可D3受體KO小鼠活動增加 ,但在高劑量下與 WT 型無差別。D3受體KO小鼠對***的偏愛效應(yīng)更敏感, 因?yàn)楹苄┝康?**就能使其形成位置偏愛。Xu[9 ]認(rèn)為正常情況下D3受體可能起著對抗D1和D2受體的作用,在D3受體KO小鼠 ,這種 D3 受體的對抗作用沒有了,使***的作用更加明顯,較小劑量就能發(fā)揮效應(yīng)。

3. 4 D4 受體

D4 受體 KO小鼠基礎(chǔ)活動降低, 對D4受體激動劑氯氮平的敏感性也降低,但乙醇、***、**基***使D4受體KO小鼠活動增多[10 ],其機(jī)制還不清楚。關(guān)于D4受體KO小鼠的依賴性特性還缺乏研究資料。

3. 5 DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體

DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine t ransporter , DAT)位于突觸前膜,重攝取突觸間隙中的DA進(jìn)入神經(jīng)末梢,是終止DA生理效應(yīng)的主要方式。DAT KO小鼠體重增長緩慢,成熟之前易死亡,但生殖能力旺盛,母鼠分娩后缺乏哺乳行為。該自發(fā)活動明顯增加, 但對***和***的運(yùn)動增強(qiáng)或刻板活動特性反應(yīng)減弱 , 說明 DAT 是***和***的作用靶位點(diǎn)。在依賴性實(shí)驗(yàn)中,***使 WT 型和 DAT KO小鼠都形成靜脈自身給藥和偏愛效應(yīng)[11 ],**同樣可使 KO 型形成偏愛效應(yīng)[12 ]。與之相矛盾的是,在正常鼠 ,DAT 阻滯劑可以抑制***的自身給藥。

3. 6 囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體

囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體 (vesicular monoamine t rans2porter , VMAT) 的作用是將單胺類從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡儲存,分為1型和2型, VMAT2 主要分布于神經(jīng)末梢,對DA、組胺、5 - HT 等單胺類特異性較高。Wang 等[13 ]培育了VMAT2基因缺陷小鼠, 發(fā)現(xiàn)該小鼠成活率低, 出生后幾天內(nèi)即死亡, 以后的實(shí)驗(yàn)只能用雜合子和 WT 型進(jìn)行。在雜合子小鼠,紋狀體 DA 濃度很低, K+和***誘發(fā)的DA 釋放作用也降低, 說明在雜合子 VMAT2 的功能也受到影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠對***、***和乙醇的運(yùn)動增強(qiáng)效應(yīng)比 WT 型更敏感; ***誘發(fā)WT 型產(chǎn)生偏愛效應(yīng), 而不誘發(fā)雜合子產(chǎn)生偏愛效應(yīng)[14 ]。這些結(jié)果反映 VMAT2 參與維持**的獎賞效應(yīng)。4 敲除 5 - HT受體和 5 - HT轉(zhuǎn)運(yùn)體基因研究表明 5 - 羥色胺(5 - HT) 系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)**的獎賞效應(yīng), 但目前只培育了 5 - HT1B 受體 KO小鼠和 5 - HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體 KO 小鼠。

4. 1 5 - HT1B 受體

在 5 - HT1B受體KO小鼠,***累進(jìn)比率自身給藥實(shí)驗(yàn)中的“終點(diǎn)”(break point )明顯高于WT小鼠,對食物形成的強(qiáng)化效應(yīng)在兩種小鼠相同,表明5 - HT1B 受體KO小鼠對***更易形成自身給藥。

在 5 - HT1B 受體KO小鼠,***誘發(fā)的自發(fā)活動和刻板運(yùn)動強(qiáng)于WT型; 慢性給***, WT的刻板運(yùn)動逐日增加, 而5- HT1B受體KO小鼠從d2起不再增加; 由此可見, 5 - HT1B 受體KO小鼠對***引發(fā)的自發(fā)活動增強(qiáng)更敏感, 而WT小鼠對***的刻板運(yùn)動更敏感。一般認(rèn)為, 黑質(zhì)紋狀體DA 系統(tǒng)與刻板運(yùn)動有關(guān), 中腦邊緣DA系統(tǒng)與自發(fā)活動和獎賞效應(yīng)有關(guān)。因此, 以上實(shí)驗(yàn)說明在5 - HT1B 受體 KO 小鼠 , 中腦邊緣 DA 系統(tǒng)的活動更為突出。**組化實(shí)驗(yàn)顯示,KO 型小鼠伏隔核的△FosB 等 Fos 相關(guān)抗原表達(dá)增強(qiáng),這種增強(qiáng)在 WT小鼠慢性給***時出現(xiàn), 說明5 - HT1B受體 KO小鼠遺傳上的特點(diǎn)與 WT 小鼠慢性給***出現(xiàn)的變化相似。因此, 興奮劑對5 - HT1B 受體KO小鼠更易產(chǎn)生獎賞效應(yīng)[15 ]。但*近卻發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果,***不能使 5 - HT1B 受體 KO 小鼠形成位置偏愛效應(yīng)[16 ]。結(jié)果不一致的原因有待于進(jìn)一步研究。4. 2 5 - HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體5 - HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin t ransporter ,5 - HTT)位于 5 - HT 神經(jīng)元的突觸前膜,重攝取突觸間隙中的 5 - HT 進(jìn)入神經(jīng)末梢。在5 - HTT KO 小鼠模型上 , ***仍能形成偏愛效應(yīng), 說明 5 - HTT 的缺失不影響***的獎賞效應(yīng)[11 ]。

5 敲除 CB1 受體基因

**受體分為CB1和CB2型受體 , CB1型受體主要分布于神經(jīng)系統(tǒng) ,與**的精神作用有關(guān)。Ledent等[17 ]培育了CB1受體KO小鼠。對WT型及CB1受體KO小鼠都給予△9- THC , 發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛、活動減少、體溫降低、血壓下降、戒斷反應(yīng)及自身給藥等作用在 WT 小鼠出現(xiàn),而在 CB1 受體 KO 小鼠不出現(xiàn) , 說明**類的主要藥理學(xué)特性是由CB1受體介導(dǎo)的。

若將兩種鼠都用**類處理, 發(fā)現(xiàn)**急性給藥的鎮(zhèn)痛、降溫作用和多次給藥的鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象,以及 U50488H 的鎮(zhèn)痛和活動減少效應(yīng)在兩種鼠沒有差別。但與 WT 型相比 ,CB1 受體 KO 小鼠的**戒斷癥狀明顯減輕,**自身給藥現(xiàn)象明顯減弱,也不對 U50488H 形成條件性位置厭惡效應(yīng), 說明**類的身體依賴性和精神依賴性都與CB1 受體有關(guān)。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在 CB1 受體 KO 小鼠 , **不能引起伏隔核DA 釋放[18 ],說明 CB1 在**促伏隔核DA釋放中發(fā)揮一定作用。

6 敲除一氧化氮合酶基因

在神經(jīng)系統(tǒng),一氧化氮(NO)可作為一種信息傳遞物質(zhì)參與腦內(nèi)多種生理功能。近年來證明,NO 參與**耐受和依賴, NO合酶(NOS)抑制劑可減輕**的戒斷癥狀。而敲除 NOS 基因的小鼠對***的運(yùn)動增強(qiáng)和行為敏化反應(yīng)減弱, 對***也不形成位置偏愛[19],進(jìn)一步驗(yàn)證了NO在**獎賞效應(yīng)中的作用。

7 其它

不同實(shí)驗(yàn)室還培育了許多敲除其它基因的轉(zhuǎn)基因動物 , 其中有些做過與**依賴性有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。如: ***急性給藥可誘導(dǎo)正常鼠前皮質(zhì)組織纖溶酶原激活因子 (t issue plasminogen act ivator, t PA)表達(dá), 在KO小鼠 ,***的活動增強(qiáng)和行為敏化效應(yīng)比WT型強(qiáng); KO和WT 型都能形成***的自身給藥, 但形成自身給藥后如果只給信號刺激不給***, WT型壓桿率降低 , 而KO型壓桿率不降低,說明tPA在依賴性中可能發(fā)揮比較特殊的作用[20 ]。再如:尼古丁可刺激WT小鼠紋狀體釋放DA ,而在敲除N型膽堿受體β2亞單位的小鼠,尼古丁就沒有這種作用。說明N受體參與尼古丁的精神依賴性[21]。*近發(fā)現(xiàn)敲除P物質(zhì)受體,**的戒斷癥狀和獎賞效應(yīng)都減弱[22 ]。

8 結(jié)語

利用基因敲除技術(shù)選擇性敲除某特定基因, 為研究該特定基因在依賴性中作用提供了直接依據(jù)。利用該模型研究各種遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)體以及各種代謝酶在依賴性中的作用已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。這種實(shí)驗(yàn)方法特異性高, 避免了受體拮抗劑特異性低的缺點(diǎn) ,可以“真實(shí)”地體現(xiàn)目的基因的活動特性。但任何事物都有兩重性,有優(yōu)點(diǎn) ,也有缺點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因動物通過基因改造造成了動物先天的遺傳異常, 生長發(fā)育過程中可能會發(fā)生一些意想不到的變化, 況且一種基因敲除了,其它基因功能可能代償性增強(qiáng),這就為解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困難, 這也可能是在有些轉(zhuǎn)基因動物上取得的結(jié)果與在正常動物上用特異性拮抗劑取得的結(jié)果不一致的原因之一。目前正在發(fā)展中的條件性基因敲除技術(shù)可以在成年鼠使某一基因突變 , 從而避免了發(fā)育過程中的遺傳缺陷。相信在不久的將來,隨著各種技術(shù)的成熟,利用轉(zhuǎn)基因動物研究**依賴性的機(jī)制乃至篩選****都將得到進(jìn)一步發(fā)展 。