摘要　建立了一套通過(guò)大腸桿菌表達(dá)(H is) 62 A rg2 A rg2人胰島素原[ (H is) 62 A rg2 A rg2 human p ro insulin,
RRhP I]制備重組人胰島素的工藝。將大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的RRhP I依次經(jīng)過(guò)DEA E2瓊脂糖快流速陰離
子交換層析, Sephadex G225 層析, 重組復(fù)性酶切轉(zhuǎn)化和 Superdex75 分子篩, 制備重組人胰島素。SDS2 PA GE、
HPLC、氨基酸組成分析和小鼠驚厥實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明, 制備的重組人胰島素具有天然生物活性, 而且純度較高。
關(guān)鍵詞　重組人胰島素　純化　DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑　Superdex75
Prepara t ion of Recombinan t Human In sul in—Study of Down stream Proces
Yu Rong
1, 2
　L i Xiaohong
1
　Yang J iyu1
　WuWutong
2, $
1 (D ep artm ent of B iop harm aceu tics, W est Ch ina S chool of P harm acy , S ichuan U niversity , Cheng d u　610041, Ch ina)
2 (T he S chool of L if e S cience & T echnology , Ch ina P harm aceu tical U niversity , N anj ing　210009, Ch ina)
　　Abstract　Th is study w as intended to establish a method of p reparat ion of recombinant human insulin,w ith
(H is) 62 A rg2 A rg2 human p ro insulin (RRhP I ) exp ressed by Escher ich ia co li . A f ter DEA E2 Sepharo se Fast F low ion2
exchange ch romatography, Sephadex G225 ch romatography and refo lding, enzyme cleavage and Superdex 75 size
exclusion ch romatography, the RRhP I exp ressed by Escher ich ia co li in inclusion body fo rm w as conver ted to human
insulin . The obtained recombinant human insulin w as analyzed by SDS2 PA GE, HPLC, am ino acid compo sit ion
analysis and bio ident ity test (mouse convulsion test). The results indicate that our obtained p reparat ion is h igh ly
pureif ied, act ive recombinant human insulin .
Key words　Recombinant human insulin　　Pur if icat ion　　DEA E2 Sepharo se fast f low　　Superdex75
1　引　言
分離純化是基因工程**生產(chǎn)中極其重要的一
環(huán), 這是由于工程菌經(jīng)過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)后, 產(chǎn)生的有效
成分含量很低, 雜質(zhì)含量卻很高; 另外由于基因工程
**是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞, 而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的, 因此
對(duì)產(chǎn)品的純度要求也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。所以要得到合
乎醫(yī)用要求的基因工程**, 分離純化要比傳統(tǒng)產(chǎn)
品困難得多。在重組人胰島素(Recom b inan t hum an
in su lin, rh I)的基因工程生產(chǎn)中, 同樣面臨著下游處
理非常復(fù)雜的問(wèn)題。為了能有效地純化目的產(chǎn)物, 目
前基因工程生產(chǎn)中普遍使用的是親合層析和HPLC
等手段, 這些分離純化技術(shù)雖然分辨率高, 特異性
強(qiáng), 但十分昂貴。不利于降低成本。為了降低生產(chǎn)成
本, 本研究建立了一套由(H is) 62 A rg2 A rg2人胰島素
原[ (H is) 62 A rg2 A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ]制
備重組人胰島素的下游純化工藝, 并對(duì)產(chǎn)品的性質(zhì)
和純度進(jìn)行了鑒定。
　　RRhP Iö pQ E240 大腸桿菌M 15 菌株。
2 . 2　主要試劑
DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑為杭州爭(zhēng)
光樹(shù)脂有限公司產(chǎn)品, Sephadex 為 Sigm a 公司產(chǎn)
品, Superdex75 為Am ersham 公司產(chǎn)品, 胰蛋白酶
和羧肽酶B 均為Sigm a 公司產(chǎn)品, 低分子量蛋白標(biāo)
準(zhǔn)為上海東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品, 人胰島素標(biāo)
準(zhǔn)品為Roche D iagno st ics Co rpo rat ion 產(chǎn)品, 谷胱
甘肽(氧化型和還原型)為上海博奧生物科技有限公
司產(chǎn)品,DTT 為O rgan ics Inc . 產(chǎn)品, 其它化學(xué)試劑
均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口飛行純。
2 . 3　菌培養(yǎng)和RRhP I的表達(dá)
參照文獻(xiàn)[1 ]。
2 . 4　包涵體的收集和洗滌
參照文獻(xiàn)[1 ]。
2 . 5　RRhP I的初步純化
DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析柱用 302　材料與方法
2 . 1　工程菌
$ 聯(lián)系人。E2 mail :wuw tong@mailbox . cpu . edu . cn
mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿素, pH8. 0 平衡, 包
涵體用 30 mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿素, 50
mmo lö L DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合適的氯化
鈉梯度進(jìn)行洗脫, SDS2 PA GE 確定RRhP I組分, 收
集含RRhP I的洗脫液。
2 . 6　復(fù)性及酶切轉(zhuǎn)化
將初步純化后的RRhP I在 Sephadex G225 層
析柱上脫尿素, 轉(zhuǎn)換緩沖液進(jìn)行重組復(fù)性, 然后用胰
蛋白酶和羧肽酶B 協(xié)同酶切將RRhP I轉(zhuǎn)化為人胰
島素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo lö L ZnCl2 終止反
應(yīng)并沉淀h I。
2 . 7　h I的純化
將h I粗品用 30 mmo lö L T r is2 HCl, 8 mo lö L 尿
素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上進(jìn)行分離純化
層析柱的平衡液和洗脫液均為 0. 2 mo lö L 乙酸鈉
乙酸, pH4. 0。
2 . 8　SDS-PAGE 分析
按文獻(xiàn)[2 ]操作。
2 . 9　HPLC 分析在日本島津HPLC 儀上, 用ODS C18 反相柱
(150mm×6. 0mm )進(jìn)行分析, 流動(dòng)相為0. 2mo lö L
(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo lö L H3PO 4 調(diào)pH 至 3. 5)和
50%乙腈水溶液按 1∶1 (vö v)混合而成, 流速 1. 0
m lö m in, 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm , 上樣量 20 u l。
2 . 10　氨基酸組成分析
稱(chēng)樣品 2. 5 m g, 加6 mo lö L HCl 2 m l, 110℃水
解24 h, 蒸干后加入2 m l無(wú)離子水溶解, 直接進(jìn)樣,
在日立 835250 型氨基酸分析儀上進(jìn)行氨基酸組成
分析。
2 . 11　h I整體生物活性的鑒定
按 2000 版《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定用小
白鼠驚厥法鑒定h I的整體活性。
3　結(jié)　果
3 . 1　RRhP I的初步純化
層析圖譜見(jiàn)圖1, RRhP I主要集中在峰2。收集
峰2, 進(jìn)行SDS2 PA GE 分析, 見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示電泳
條帶主要集中在 13 KD 附近, 峰 1 為穿透峰, 此峰
中含有p I高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白質(zhì), 而絕大部分p I低于RRhP I的蛋白質(zhì)和核酸類(lèi)雜質(zhì)牢固
地結(jié)合在柱子上, 需要較高的鹽濃度才能洗脫下來(lái)。
　　表 1 是 6 次層析的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 可以看出,
RRhP I的回收率較高, 穩(wěn)定在 75%～ 80%左右。
表1　離子交換層析的RRhP I回收率峰2 主要為折疊趨于正確的單體RRhP I, 收集峰 2。
進(jìn)行SDS2 PA GE 分析。結(jié)果(見(jiàn)圖 2)顯示, 收集的
RRhP I樣品中高分子量雜蛋白的含量有所減少。峰
1 為高分子量雜蛋白和RRhP I的二聚體或多聚體
及折疊不完全或不正確的RRhP I?！　≡谑占腞RhP I單體組分中, 加入 2. 5 mmo lö
L 還原型谷胱甘肽和 0. 25 mmo lö L 氧化型谷胱甘
肽以控制2 SH 比例, 通過(guò)二硫鍵的交換形成穩(wěn)定的
具有天然結(jié)構(gòu)的RRhP I。在37℃條件下, 用胰蛋白
酶(1ö 500, 酶ö RRhP I底物)和羧肽酶B (1ö 1000, 酶
ö RRhP I底物) 協(xié)同酶切 30～ 40 m in, (H is) 62 A rg2
A rg 和C 肽被準(zhǔn)確切除, RRhP I轉(zhuǎn)化為 h I。SDS2
PA GE 結(jié)果表明, RRhP I 幾乎被完全酶切轉(zhuǎn)化為
h I, 主要電泳條帶的位置從 13 KD 附近下移至與人
胰島素標(biāo)準(zhǔn)品平行的位置, 見(jiàn)圖2。
3 . 4　h I的純化
用 0. 1 mo lö L ZnCl2 沉淀的 h I粗產(chǎn)品可通過(guò)
Superdex 75 進(jìn)行純層析圖譜見(jiàn)圖4, h I主要集中在
峰3。收集峰3 進(jìn)行SDS2 PA GE 分析, 結(jié)果顯示, 見(jiàn)
圖 2, 所得h I組份在 SDS2 PA GE 分析中是均一的,
只有一條蛋白帶。將峰3 組分透析, 濃縮并凍干, 即
可*終制得h I。
3 . 5　產(chǎn)品的性質(zhì)鑒定
3 . 5 . 1　SDS2 PA GE 分析　結(jié)果(見(jiàn)圖2)表明, 本研究得到的產(chǎn)品的分子量與h I標(biāo)準(zhǔn)品相同, 且純度較高, 在SDS2 PA GE 中呈一條蛋白帶。
3 . 5 . 2　HPLC 分析　本工藝制備的重組胰島素制
品主峰的保留時(shí)間(27. 757 m in)與標(biāo)準(zhǔn)品 h I的保
留時(shí)間(27. 968 m in)基本一致, 而與豬3 . 5 . 3　氨基酸組成分析　分析結(jié)果見(jiàn)表 2, 該結(jié)果
表明本工藝制備的重組胰島素樣品的氨基酸組成與
h I基本一致。樣品中不含M et, 與胰島素原一起表
達(dá)的(H is) 62 A rg2 A rg 已被準(zhǔn)確切除, 樣品中只剩下
1 個(gè)A rg 和 2 個(gè)H is, 這表明RRhP I已被成功地轉(zhuǎn)
化成了h I。
3 . 5 . 4　h I整體生物活性的鑒定　5 只昆明種清潔
級(jí)小白鼠(雄性20～ 24 g) , 按每20 g 體重皮下注射
h I樣品1. 25 U , 注射后 2 h 內(nèi)均出現(xiàn)降血糖陽(yáng)性反
應(yīng),其中有4 只驚厥。隨即腹腔注射1m l 5%葡萄糖
注射液, 驚厥現(xiàn)象消失。這表明本工藝制備的 h I樣
品具有很好的降血糖活性。胰島素的保4　討　論
4 . 1　RRhP I的初步純化床要求等優(yōu)點(diǎn)。但是HPLC 具有對(duì)軟硬件的要求較
高, 前期投入大, 純化量有限等等缺點(diǎn), 從而使生產(chǎn)
能力受到影響。本研究在*后純化制備人胰島素時(shí)
選用的是 Superdex 75 分子篩層析, 其具有機(jī)械強(qiáng)
度高, 穩(wěn)定性好, 重現(xiàn)性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨
率高(13 000 p latesö m ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m lö
m in, 25℃) , 且可在低壓下操作, pH 范圍廣(3～
12) , 分離范圍廣 (球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特異性
吸附小, 負(fù)載量大, 層析條件易控制等等優(yōu)點(diǎn), 是一
個(gè)非常理想的純化基因工程產(chǎn)品的層析方法。用0.
2 mo lö L 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0 的緩沖液作平衡液和
洗脫液, 將 h I粗品經(jīng)過(guò) Superdex 75 柱層析后, 我
們得到了純度較高的人胰島素制品, SDS2 PA GE 分
析樣品只有一條帶。目前尚未見(jiàn)采用 Superdex 75
純化基因工程產(chǎn)品的有關(guān)報(bào)道。
胰島素是天然生物活性物質(zhì), 必須保持天然的
二級(jí)結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮降血糖的生物活性。小鼠驚厥實(shí)
驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果充分表明, 本研究所選擇的層析條件
不但有效地純化了表達(dá)產(chǎn)物, 而且有效地防止了目的具有天然活性的基因工程人胰島素。
致謝: 本教研室研究生祁暉在研究工作中給予了大力的支持!
參 考 文 獻(xiàn)
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4 Jonasson P,N ilsson J , Samuelsson E, et al . Single2step t ryp sin
標(biāo)產(chǎn)物h I的失活變性, 本研究*終制備了純度較高
為了快速準(zhǔn)確地從大量的雜蛋白中捕獲目標(biāo)產(chǎn)
留時(shí)間(25. 437 m in)有明顯差別。