【摘要】目的明確pERK1 /2在大鼠腦內(nèi)的分布及Y迷宮訓(xùn)練后的時程變化。方法55只健康成

年SD大鼠,分為正常對照組, Y迷宮訓(xùn)練組,假訓(xùn)練組,其中訓(xùn)練組與假訓(xùn)練組再各分為訓(xùn)練后0h、1h、3h、

6h、24h亞組,每組動物各5只。訓(xùn)練組動物接受Y2迷宮光電結(jié)合訓(xùn)練,假訓(xùn)練組動物接受光電不結(jié)合假

訓(xùn)練,應(yīng)用**組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腦內(nèi)各區(qū)pERK1 /2陽性神經(jīng)元分布及表達的變化。結(jié)果正

常對照組pERK1 /2**陽性神經(jīng)元分布較少,但在雙側(cè)視上核、室旁核表達很豐富,其次在小腦分子層和

浦肯野細胞層、杏仁核、紋狀皮層表達較多,海馬部位偶見2～5個陽性神經(jīng)元,有較多陽性纖維著色,在紋

狀體整個區(qū)域無陽性神經(jīng)元表達。在訓(xùn)練后0 h紋狀體尾殼核和邊緣區(qū)[ (31. 2 ±4. 8)個]出現(xiàn)表達,在海

馬CA2、CA3區(qū)出現(xiàn)較多陽性神經(jīng)元胞體[ (44. 2 ±4. 2)個] ,皮層大部、杏仁核的表達也有明顯增強,而訓(xùn)

練后1h、3h、6h上述各區(qū)仍有持續(xù)增強,訓(xùn)練后24 h表達降至正常,紋狀體邊緣區(qū)陽性神經(jīng)元消失,海馬部

位僅有個別陽性神經(jīng)元[ (3. 8 ±3. 3)個] , P值均小于0. 01。假訓(xùn)練組各時間點在海馬、紋狀體尾殼核、邊

緣區(qū)等部位均無或僅有個別陽性細胞或陽性纖維,與訓(xùn)練組相比差異顯著。結(jié)論正常狀態(tài)下pERK1 /2

在全腦分布較為局限,且表達強度較低。Y迷宮學(xué)習(xí)可誘導(dǎo)海馬、尾殼核、紋狀體邊緣區(qū)等區(qū)域的pERK1 /2

的表達,而且pERK1 /2參與了Y迷宮的習(xí)得、短期記憶的形成、短期記憶向長期記憶的轉(zhuǎn)換和長期記憶的

形成等學(xué)習(xí)記憶的各個階段。

【關(guān)鍵詞】學(xué)習(xí)記憶; pERK1 /2; 大鼠; 腦

MAPK/ERK途徑是一條進化保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途

徑,參與多種生理應(yīng)答,包括細胞增殖,細胞存活、分

化,在神經(jīng)元細胞中,參與突觸可塑性[ 123 ] 。ERK接受

上游分子MAPKK (MAPK Kinase,MAPK 激酶, 又稱MEK2 /MEK1)的磷酸化調(diào)控信號后, 相鄰的酪氨酸和

蘇氨酸均被磷酸化,從而成為活化形式的pERK 。被

激活的pERK使胞漿中其他一些酶磷酸化而直接發(fā)揮

生物學(xué)效應(yīng); 或者轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi), 使一些轉(zhuǎn)錄因子

磷酸化從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的基因表達。越來越多的證據(jù)

表明該途徑參與認知功能,如學(xué)習(xí)與記憶形成[ 427 ] 。本研究使用電Y迷宮大鼠主動逃避學(xué)習(xí)模式探討大鼠

pERK1 /2在在全腦內(nèi)的分布和訓(xùn)練后不同時間段

pERK1 /2表達的變化。

材料與方法

一、實驗動物與分組

雄性Sp rague2Dawley大鼠55只(**軍醫(yī)大學(xué)實

驗動物中心提供) ,體質(zhì)量200～250 g,保持光照/黑暗

12h循環(huán)恒定,食物由實驗中心提供,飲用自來水。動

物隨機分為以下3組: 1) Y迷宮訓(xùn)練組; 2)假訓(xùn)練組;

3)正常對照組。訓(xùn)練組與假訓(xùn)練組再各分為訓(xùn)練后

0 h、1 h、3 h、6 h、24 h亞組,每亞組動物各5只。

二、Y迷宮訓(xùn)練

各組動物在Y型迷宮中適應(yīng)3 d后開始訓(xùn)練。訓(xùn)

練組光電結(jié)合:電Y型迷宮3條臂的盡頭均有一燈,

底部是電網(wǎng),實驗時其中有一條臂末端的燈發(fā)出亮光,

此時該臂底部電網(wǎng)無電流通過,為**臂;另兩臂末端

的燈不亮,底部電網(wǎng)通電(約50～70V) ,為非**區(qū)

臂。**臂與非**臂隨機改變。每當(dāng)大鼠到達**

臂30 s后再隨機改變**臂的位置,轉(zhuǎn)變5 s后非**

臂底部電網(wǎng)即有脈沖電流通過,刺激正常大鼠足底而

驅(qū)使其跑向**臂。大鼠在10 s內(nèi)從非**臂一次性

跑向**臂即被判為正確,否則均判為錯誤。每次訓(xùn)

練在每只大鼠上重復(fù)60次,記錄正確次數(shù),少于25次

被視為不合格,從訓(xùn)練組中去除,并隨時補充動物,保

證每組只數(shù)不變。假訓(xùn)練組光電不結(jié)合:給光與給電

之間無固定關(guān)系,每次**臂與給光臂各自隨機出現(xiàn),

也以大鼠跑進**臂并達30 s為一次訓(xùn)練,同樣連續(xù)

訓(xùn)練60次。正常對照組動物不接受任何訓(xùn)練。

三、標本取材

上述各組動物進行實驗后規(guī)定時間內(nèi)腹腔內(nèi)注射

10%水合氯醛(4mg/100 g) 麻醉動物。開胸后剪開右

心耳,從左心室插管至主動脈,先用150ml生理鹽水

(室溫) 快速灌注,隨后用含4%多聚甲醛的0. 1M磷

酸鈉鹽緩沖液500ml ( 4 ℃) 灌注固定2 h。把腦取出

后放入含30%蔗糖的0. 1M磷酸鈉鹽緩沖液中,并置

于4 ℃冰箱內(nèi)直到沉底。冠狀冰凍切片,厚度35μm。

切片依次分成2套,一套做pERK1 /2**組化,另一

套為**組化對照。

四、染色方法

切片先經(jīng)0. 01mol/L 的PBS緩沖液( pH = 7. 4)

漂洗10min ×3 次,再置于預(yù)孵液(含3 g/L Triton X2

100、2 g/L 正常山羊血清、1 g/L 牛血清白蛋白、1 g/L

疊氮鈉) 中預(yù)孵1 h后,加兔抗單克隆pERK1 /2抗體

(1: 200, Cell Signaling Technology 公司) , 在濕盒中

4 ℃孵育40 h。再加入羊抗兔IgG ( 1 ∶200, Vector 公

司) ,室溫下置于搖床中孵育2 h,卵白素2生物素復(fù)合

物(1∶100, Vector公司) 中,室溫下置于搖床中孵育色。上述各步驟之間都經(jīng)0. 1mol/L PBS 液漂洗

15min ×3次。*后切片經(jīng)常規(guī)脫水、透明、封片。陰

性對照用正常二抗同源血清代替一抗,其他步驟相同。

五、陽性細胞計數(shù)及統(tǒng)計分析

在Olympus顯微鏡下分別對訓(xùn)練組、假訓(xùn)練組及

對照組動物各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的pERK1 /2**陽

性細胞進行計數(shù)。每只動物,各腦區(qū)均取5張連續(xù)切

片,獲得該區(qū)陽性神經(jīng)元均數(shù),*后計算每組大鼠每個

腦區(qū)pERK1 /2**陽性神經(jīng)元平均數(shù),均數(shù)采用x ±s

表示。統(tǒng)計分析采用SPSS13. 0軟件,組間分析采用

one2way ANOVA檢驗。

結(jié)果

一、正常對照組pERK1 /2**陽性神經(jīng)元在全腦

內(nèi)的分布

正常組pERK1 /2**陽性神經(jīng)元在全腦內(nèi)分布

較少,但在雙側(cè)下丘腦視上核、下丘腦室旁核表達很豐

富,其次在小腦分子層和浦肯野細胞層、杏仁核、部分

皮層表達較多,海馬部位偶見2～5個陽性神經(jīng)元,但

有較多陽性纖維著色;在前額葉、尾殼核、邊緣區(qū)、蒼白

球、腦干各核團內(nèi)及其他腦區(qū)僅有微弱或無表達。

二、訓(xùn)練后不同時間點pERK1 /2**陽性神經(jīng)元

表達情況的比較

訓(xùn)練后各時間點表達分布與正常對照組相比出現(xiàn)

差異,一些腦區(qū)表達強度出現(xiàn)增強。其中在正常組沒

有表達的紋狀體尾殼核和邊緣區(qū)在訓(xùn)練后0 h出現(xiàn)表

達,在海馬CA2、CA3區(qū)則出現(xiàn)較多陽性神經(jīng)元胞體,

皮層大部、杏仁核、丘腦室旁核、小腦浦肯野細胞、下丘

腦視上核、下丘腦室旁核、室周核、部位的表達有明顯

增強,而訓(xùn)練后1 h、3 h、6 h上述各區(qū)仍有持續(xù)增強,訓(xùn)

練后24 h表達降至正常,紋狀體邊緣區(qū)和海馬陽性神

經(jīng)元消失,海馬部位僅有個別陽性神經(jīng)元。假訓(xùn)練后

不同腦區(qū)表達增強情況不盡相同。在訓(xùn)練后0 h、1 h、3

h、6 h皮層大部、杏仁核、嗅內(nèi)皮層、下丘腦視上核、下

丘腦室旁核、室周核表達有明顯增強,假訓(xùn)練后24 h

降至正常。但假訓(xùn)練組在海馬僅見少量陽性細胞,在

紋狀體尾殼核、邊緣區(qū)部位無或僅有個別陽性細胞。

見表1。

表1 pERK1 /2**陽性神經(jīng)元數(shù)量在訓(xùn)練后各時間點

表達的變化(個, x ±s , n = 5)

組別邊緣區(qū)杏仁核海馬皮層

正常組- - 9. 4 ±4. 3 3. 4 ±1. 5 7. 2 ±1. 9

訓(xùn)練后0 h 31. 2 ±4. 8

3

65. 2 ±11. 3

3

44. 2 ±4. 2

3

73. 6 ±6. 3

3

訓(xùn)練后1 h 32. 0 ±5. 4

3

63. 6 ±5. 7

3

39. 8 ±4. 1

3

48. 4 ±4. 3

3

訓(xùn)練后3 h 32. 8 ±5. 6

3

54. 2 ±8. 6

3

33. 0 ±4. 5

3

31. 0 ±4. 1

3

訓(xùn)練后6 h 27. 0 ±5. 5

3

39. 8 ±8. 1

3

23. 8 ±4. 8

3

28. 2 ±2. 9

3

訓(xùn)練后24 h - - 9. 6 ±5. 1 3. 8 ±3. 3 8. 8 ±2. 8

注:與正常組相比3

P < 0. 01

2 h。

討論

紋狀體邊緣區(qū)(marginal division, MrD)是舒斯云

首先于1987年在大鼠腦紋狀體發(fā)現(xiàn)的一個新亞區(qū),其

位于紋狀體的尾側(cè),環(huán)繞蒼白球的頭外側(cè),由緊密排列

的梭形細胞構(gòu)成。動物實驗和人活體功能核磁共振已

初步證明MrD 與腦的學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[ 7210 ] 。

本實驗中發(fā)現(xiàn)雖然在正常情況下邊緣區(qū)沒有pERK1 /2

表達,但在Y迷宮訓(xùn)練后有明顯表達,是學(xué)習(xí)記憶依賴的,表

明在邊緣區(qū)中也存在pERK1/2激活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

本實驗中以Y2迷宮訓(xùn)練作為主動逃避性學(xué)習(xí)的

模型,分別在訓(xùn)練后0 h、1 h、3 h、6 h、24 h用**組織

化學(xué)方法檢測pERK1 /2在腦內(nèi)的分布和表達強度,以觀察該蛋白在大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)Y2迷宮行為的

習(xí)得、習(xí)得向短期記憶的轉(zhuǎn)變、短期記憶、短期記憶向

長期記憶的轉(zhuǎn)變以及長期記憶已經(jīng)形成后的活化強度

和分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常狀態(tài)下,雙側(cè)下丘腦視上核

表達就極為豐富,下丘腦室旁核表達也很豐富,其原因

尚不清楚。由于pERK1 /2參與了細胞多種生理活動,

即使沒有較強的學(xué)習(xí)記憶等刺激,也可能在腦內(nèi)不同

腦區(qū)表達,因此,我們的實驗中發(fā)現(xiàn)正常組小腦分子層

和浦肯野細胞層、杏仁核、紋狀皮層有少量陽性神經(jīng)元

表達pERK1 /2,表明這些部位在正常狀態(tài)下就有ERK

的激活。假訓(xùn)練組大鼠皮層大部、杏仁核、嗅內(nèi)皮層在

訓(xùn)練后0 h、1 h、3 h、6 h都有表達增強則表明訓(xùn)練環(huán)境

中各種刺激如電擊、燈光、外界環(huán)境的變化等都可引起相

應(yīng)核團pERK1/2的升高,但是這種升高并不是學(xué)習(xí)記憶特

異的,而是這些刺激本身的物理性而導(dǎo)致的。

在海馬、尾殼核、邊緣區(qū)等與Y迷宮學(xué)習(xí)緊密相

關(guān)的幾個腦區(qū)正常狀態(tài)及假訓(xùn)練時均沒有明顯的

ERK的激活。海馬部位僅偶見2～5個陽性神經(jīng)元。

但是在訓(xùn)練后0 h、1 h、3 h、6 h,海馬CA2、CA3區(qū)、紋狀

體邊緣區(qū)、尾殼核等學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)表達明顯增強,

表明在這些區(qū)域pERK1 /2的表達是學(xué)習(xí)依賴的,而且

參與了Y2迷宮學(xué)習(xí)記憶的習(xí)得、短期記憶的形成、短

期記憶向長期記憶的轉(zhuǎn)換、長期記憶的形成等各個階

段。訓(xùn)練后24h pERK1 /2表達降至正常水平,上述各

相關(guān)腦區(qū)表達再次變得微弱或沒有。訓(xùn)練組在訓(xùn)練后

各個時間點同樣也有皮層大部、杏仁核、嗅內(nèi)皮層等區(qū)

域pERK1 /2 表達的增強,其原因可能與假訓(xùn)練組一

樣,是環(huán)境中物理性因素造成的。Walz等[ 11, 12 ]在之前

的研究也已經(jīng)證明了大鼠跳臺抑制性逃避任務(wù)的長期

保持可被海馬、杏仁體、內(nèi)嗅皮層、頂葉皮層后部注射

MAPK抑制劑PD098059 而導(dǎo)致時間依賴性的破壞。

他們將MEK抑制劑PD098059注入上述部位,觀察它

們對大鼠抑制性逃避的短期、長期保持的影響。發(fā)現(xiàn)

在訓(xùn)練后0min 海馬注射破壞了STM, 在訓(xùn)練后

180min海馬內(nèi)注射破壞長期記憶,訓(xùn)練后0min內(nèi)嗅

皮層注射破壞短期記憶, 180min破壞長期記憶,頂葉

皮層在訓(xùn)練后0min注射,杏仁核在訓(xùn)練后180min注射破壞了記憶保持。這些發(fā)現(xiàn)表明MAPK途徑時間

依賴地參與抑制性回避訓(xùn)練后的記憶處理,時間依賴

性在各腦區(qū)是不同的。在本實驗中雖然沒有使用

pERK1 /2的特異性抑制劑來觀察大鼠Y2迷宮行為的

變化,但從另一方面給出了pERK1 /2在該行為模式學(xué)

習(xí)記憶各個階段的變化趨勢,為進一步應(yīng)用抑制劑研

究其在各腦區(qū)各時間點的功能提供了基礎(chǔ)依據(jù)。換句

話說,也給Walz等[ 11, 12 ]的研究一定意義上提供了一

些補充。但pERK1/2在該行為模式各階段學(xué)習(xí)記憶中的

作用和其在相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的地位值得進一步研究。