荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究

懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

摘要：目的  觀察荷瘤小鼠大腦皮層和海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)水平變化，初步探討荷瘤應(yīng)激引起抑郁的分子機(jī)制。方法  建立荷瘤小鼠模型；以不同荷瘤時(shí)間的懸尾實(shí)驗(yàn) （tail-suspension test，TST）的反應(yīng)作為抑郁行為學(xué)指標(biāo)；采用半定量及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別測(cè)定荷瘤12d后小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平。結(jié)果  荷瘤組小鼠在TST中的不動(dòng)時(shí)間隨腫瘤接種時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，于荷瘤第12天顯著降低。同時(shí)，荷瘤第12天的小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平也明顯降低，氟西汀處理可增加海馬BDNF的表達(dá)。結(jié)論  荷瘤應(yīng)激可通過(guò)降低海馬及大腦皮質(zhì)BDNF水平誘發(fā)抑郁絕望狀態(tài)。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

關(guān)鍵詞：荷瘤；抑郁；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；氟西汀懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

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懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

 荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

The study on the development of depression in H22 tumor-bearingmice懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

Abstract:  Objective To explore the molecular mechanisms of depression development inH22 tumor-bearing mice. Methods  Tail-suspension test (TST) wasobserved as the despair behavioral response in H22 tumor-bearingmice. The expression of BDNF in the cerebrum and hippocampus ofmice were determined by RT-PCR and real time quantitative RT-PCRrespectively. Results  The immobility time in TST was increased asthe tumor developed, and it changed significantly at 12 days aftertumor implantation. In the mean time, the expression of BDNFdecreased significantly in H22 tumor-bearing mice. The decreasedexpression of BDNF in hippocampus could be antagonized byfluoxetine for 12 days of treatment. Conclusion  Tumor burden might induce stress-relateddepressive state by down-regulating the expression ofBDNF.

Key words tumor-bearing；depression；BDNF;Fluoxetine懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

臨床大量研究表明腫瘤患者的抑郁癥發(fā)病率及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出一般人群，但缺乏關(guān)于腫瘤與抑郁之間關(guān)系的基礎(chǔ)研究。關(guān)于抑郁的發(fā)病機(jī)制說(shuō)法不一，目前較公認(rèn)看法認(rèn)為與應(yīng)激及應(yīng)激性**關(guān)系密切。Sterling和Eyer于1988年提出了"非穩(wěn)態(tài)（allostasis）概念，McEwen等又于1993年詳細(xì)描述了非穩(wěn)態(tài)負(fù)荷(allostasis load), 即指機(jī)體偏離機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)的程度。非穩(wěn)態(tài)負(fù)荷可使機(jī)體通過(guò)調(diào)整達(dá)到穩(wěn)態(tài)。正是由于非穩(wěn)態(tài)，自主神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸和機(jī)體各系統(tǒng)不僅能對(duì)內(nèi)源性和外源性應(yīng)激源產(chǎn)生積極反應(yīng)以保護(hù)機(jī)體,也會(huì)因慢性過(guò)度的或消極的反應(yīng)而導(dǎo)致機(jī)體的紊亂和衰竭。研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可以通過(guò)下調(diào)抑郁癥患者大腦海馬及大腦皮質(zhì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived nuerotrophic factor, BDNF）水平致神經(jīng)元損傷和萎縮、影響神經(jīng)元再塑和神經(jīng)發(fā)生、使海馬體積改變^[1]。CT、MRI檢查結(jié)果也證實(shí)抑郁癥患者均有不同程度的大腦皮質(zhì)和海馬容積減少。同時(shí)大量證據(jù)發(fā)現(xiàn)癌癥患者及荷瘤動(dòng)物血漿中應(yīng)激**包括GCS, ACTH等均有不同程度的改變。因此，我們提出假設(shè)：腫瘤作為一機(jī)體的惡性刺激，是否可影響機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，*終誘發(fā)抑郁狀態(tài)。我們擬通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)（tail-suspension test, TST）測(cè)定荷瘤小鼠不動(dòng)時(shí)間來(lái)觀察其抑郁狀態(tài)，并通過(guò)PCR技術(shù)來(lái)測(cè)定其海馬及大腦皮質(zhì)中BDNF表達(dá)，從而從分子水平研究其抑郁狀態(tài)發(fā)生的機(jī)制，初步闡明腫瘤與產(chǎn)生抑郁的關(guān)系。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

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1  材料與方法懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

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1.1  試劑及動(dòng)物：鹽酸氟西?。?/span>Fluoxetine）膠囊，由Eli lilly and companylimited生產(chǎn)，規(guī)格：20mg/每粒，批號(hào)：20040715。健康balb/c雄性小鼠，體重18+2g；雄性肝癌H22腹水瘤小鼠，均為上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

1.2  動(dòng)物分組及荷瘤模型的建立  隨機(jī)將健康小鼠分為3組，正常對(duì)照組，荷瘤組及荷瘤氟西汀處理組。取腹水瘤的種鼠，處死后抽取腹水液，生理鹽水稀釋4倍配制成瘤細(xì)胞懸液，約1×10⁷個(gè)/ml,0.2ml皮下接種于小鼠右腋下。荷瘤加氟西汀組小鼠每日用氟西汀20mg/kg灌胃一次。

1.3  懸尾實(shí)驗(yàn)  將小鼠倒置懸吊，在5分鐘內(nèi)計(jì)算小鼠靜止的時(shí)間.

1.4  RT-PCR法測(cè)定大腦皮層組織BDNF的表達(dá)  小鼠處死后，取出海馬組織，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA。BDNF及beta-actin的引物序列分別為5’-TCATTGGTAACCTCGCTCAT-3’; 5’-CCGAACCTTCTGGTCCTC-3 和5’-ACAGGCATTGTGATGGACTC-3’;5’-TTGATGTCACGCACGATTT-3。

1.5  實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定海馬BDNF的表達(dá)  2-SYBR為PCR的綠色熒光標(biāo)記，引物序列為5’-GAGTCTTTGGTGGTTTGTGA-3’及5’-GCTCGGGTAGTTCGCTTTA-3’。95°C持續(xù)15分鐘，然后經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)使cDNA擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括15秒94°C高溫變性、30秒56°C低溫退火、30秒72°C延伸。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（Mean±s），采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為顯著性差異。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

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2  結(jié)果懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

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2.1  荷瘤對(duì)小鼠TST的不動(dòng)時(shí)間的影響  TST是經(jīng)典的抑郁行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，小鼠為克服不正常體位而掙扎活動(dòng), 但活動(dòng)一定時(shí)間后, 出現(xiàn)間隙性不動(dòng), 顯示“失望”狀態(tài), 因此，小鼠的不動(dòng)時(shí)間反映了其抑郁狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，分別在第0天、第6天、第8天以及第12天測(cè)定小鼠的不動(dòng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著荷瘤時(shí)間的增長(zhǎng)，小鼠的不動(dòng)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。而氟西汀連續(xù)處理12天可顯著縮短荷瘤小鼠的不動(dòng)時(shí)間（圖1）。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

圖1 荷瘤對(duì)小鼠TST不動(dòng)時(shí)間的影響懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

Fig 1. Effects ofH22 tumor implantation on the immobility time (s) in the TST ofmice (Mean±s, n=10) 懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

**P<0.01 vs before tumor implantation；^c P<0.01 vs 12days after tumor implantation

2.2  荷瘤對(duì)小鼠海馬BDNF表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明海馬組織中的BDNF表達(dá)下降，氟西汀處理12天后BDNF表達(dá)上調(diào)，與荷瘤模型組存在顯著差異（表1，圖2）。懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

表1.荷瘤對(duì)小鼠海馬BDNF表達(dá)的影響

Tab 1. BDNF level in the hippocampus of H22 tumor-bearing mice (Mean±s, n=5)

 

組別	對(duì)照組	荷瘤模型組	荷瘤氟西汀處理組
RNA相對(duì)濃度	0.96±0.05	0.34±0.10**	0.58±0.15b

**P<0.01 vs before tumor implantation；^b P<0.05 vs 12days after tumor implantation

懸尾實(shí)驗(yàn)tail-suspension test TST

 

**

b

圖2 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)測(cè)定小鼠海馬BDNF水平

Fig 2. BDNF level in hippocampus byreal-time PCR (Mean±s, n=5)

**P<0.01 vs before tumor implantation；^b P<0.05 vs 12days after tumor implantation

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2.3  荷瘤對(duì)小鼠皮層<%3