【摘要 】 　 目的 　 觀察用紫河車干預(yù)后的阿爾茨海默病 (AD)模型大鼠的腦組織內(nèi)β樣淀粉蛋白 (Aβ)、 β類淀粉前體蛋白信使
核糖核酸 (βAPPmRNA)表達(dá)改變 ,探討紫河車改善阿爾茨海默病模型大鼠癥狀的部分機制。方法 　用 Okadaic acid (OA)注于實驗
大鼠腦內(nèi)杏仁核建立 AD動物模型 ,用避暗法和穿梭箱法測試實驗大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 ,用**組織化學(xué)方法顯示實驗大鼠腦組織
內(nèi) Aβ表達(dá)的變化 ,用原位雜交方法顯示實驗大鼠腦組織內(nèi)βAPPmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 　用紫河車**和預(yù)防一段時間后的
AD模型大鼠 ,其學(xué)習(xí)記憶能力的測試成績明顯優(yōu)于同時間點模型組大鼠的成績 ( P < 0105) ,其腦組織內(nèi) Aβ、 βAPPmRNA表達(dá)數(shù)
量也明顯少于同時間點模型組大鼠腦組織內(nèi)的 Aβ、 βAPPmRNA表達(dá)數(shù)量 ( P < 0105)。結(jié)論 　 經(jīng)紫河車干預(yù)后 ,AD模型大鼠的行
為異常得到改善 ,同時其腦組織內(nèi) Aβ、 βAPPmRNA表達(dá)也受到抑制。
[關(guān)鍵詞 ]　　阿爾茨海默病;紫河車;淀粉樣β蛋白;淀粉樣β蛋白前體
Effect of Ziheche onβ2 amylo id,β2 amylo id precursor prote i n mRNA i n bra i n tissue of ra tmodel of Alzhe i mer’ s d isea se
YUAN M eng2 sh i , CHEN X iang2liang, ZHOU De2 sheng, YANG Q i2 dong . First Affiliated Hos p ital of Hunan University of TCM, Changsha
410007, China
【Abstract】 　Objecti ve　To observe the changes ofβ2 Amyl oid,β2 Amyl oid p recurs or p r otein mRNA in brain tissue of rat model of
Alzhei mer’ sDisease (AD) after interventi on with Ziheche and investigate the mechanis ms of enhancing learning and memory in ratmodel of
Alzhei mer’ sDisease by Ziheche . Methods　The rat model of Alzhei mer’ s diseases was established by stereotaxic injecti on of okadaic acid
(OA) t o one of amygdala comp lexes . The learning and memory ability of the rats was evaluated . The i mmunohist ochemistry was used t o i2
dentify the alterati ons ofβAmyl oid in brain tissue, and the in situs hybridizati on was used t o identify the alterati ons ofβAPP mRNA in brain
tissue . Results　After the ratmodel of Alzhei mer disease were treated and p revented with Ziheche, their learning and memory ability was
better than those in ratmodel ofAD without treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) , the exp ressi on ofβAmyl oid, βAPP mRNA in
brain tissue was less than that not treated or p revented with Ziheche ( P < 0105) . Conclusi on　After treated and p revented with Ziheche,
the learning and memory ability of the ratmodel ofAD was enhanced, and the exp ressi on of theβAmyl oid,βAPP mRNA in brain tissue of
the ratmodel ofAD decreased .

【Key words】 　　Alzhei mer disease; Placenta hominis ;Amyl oid beta2 p r otein;Amyl oid beta2 p r otein p recurs or
　　 從臨床實踐中表明阿爾茨海默病 (AD) 無論從
發(fā)病機制還是臨床表現(xiàn)來看 , 都與腎精虧密切相
關(guān)[ 1 ]
。紫河車屬于血肉有情之品 , 擅長**填精 , 筆
者擬從動物實驗著后來驗證其防治 AD的效果及其機
制。β淀粉樣蛋白 (β2 Amyl oid, Aβ) 異常沉積是 AD
患者腦組織內(nèi)老年斑形成的主要原因; 近年來研究表
明β淀粉樣前體蛋白 (βAPP) 基因突變是造成 Aβ
異常沉積的關(guān)鍵因素[ ]
。本文研究紫河車干預(yù) Aβ和
βAPPmRNA的表達(dá) , 現(xiàn)報告如下。
1　 材料與方法
1·1　 動物與分組、分點 　選取健康 SD 66只 , 3～4
月齡 , 體重 180～250 g, 清潔級 , 雌雄各半 , 隨機分
為模型組、**組、預(yù)防組、假手術(shù)組、空白組 , 每
組分 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d 5個觀察點 , 每個觀
察點 3只實驗大鼠。
1·2　AD大鼠模型的建立 　在腦立體定位儀上 , 用
微量注射器將 OA 1μl (相當(dāng)于 100 ng) 注入大鼠杏
仁核 (前囟后 2112 mm、矢狀縫旁 4 mm, 深 8 mm) ,
10 min左右注射完, 留針 5 min。其中假手術(shù)組緩注
射等量的生理鹽水。
1·3　 實驗大鼠的給藥 　以紫河車生藥計 2 g·kg
- 1
·d
- 1
給藥。將紫河車加工成極細(xì)粉末 , 以 100 ml
水: 25 g紫河車粉末的比例配制成液體 , 給實驗大鼠
中給藥者灌胃給藥。預(yù)防組給藥: 在造模前 7 d開始給藥 , 連續(xù) 7 d, 造模后不給藥。其他給藥組給藥:
即**組和假手術(shù)組在造模后即開始給藥 , 直到其被
取腦制標(biāo)本。
1·4　 行為學(xué)觀察 　 按觀察目的設(shè)定實驗大鼠的行為
學(xué)觀察的時間點。用避暗箱進(jìn)行被動回避反應(yīng)測試 ,
分別進(jìn)行保留試驗、獲得試驗 , 記錄測試數(shù)據(jù)[ 2 ]
。用
穿梭箱進(jìn)行主動回避反應(yīng)測試 , 分別進(jìn)行保留試驗、
獲得試驗 , 記錄測試數(shù)據(jù)[ 3 ]
。
1·5　 腦組織的切片制備 　 各組常規(guī)灌注固定 30 min
后行石蠟切片 , 隨機選取海馬相鄰切片分別作**化
實驗和原位雜交實驗。
1·6　Aβ的**組化測試 　主要步驟: 石蠟切片常
規(guī)脫蠟至水 -水浴修復(fù)抗原 - PBS洗 -滴加抗原修復(fù)
液 - PBS洗 -滴加正常羊血清封閉液 -滴加 -抗 (兔
抗鼠 IgG) 37℃, 30 min至 2 h或者 20℃ 60～120
min, 也可以 4℃ 過夜 (先 37℃, 60 min至 2 h孵育 ,
再 4℃過夜 ) - PBS洗 -滴加生物素化山羊抗兔 IgG
(即二抗 ) , 孵育 20 min - PBS洗 -滴加 S ABC -即三
述兩者之間。⑵ 造模后對各組被動逃避反應(yīng) “保留 ”
的影響: 模型組對已經(jīng)獲得的對電擊的記憶遭到破
壞 , 而假手術(shù)組則保留較好 , **組在**一段時間
后 , 對電擊記憶恢復(fù)比模型組好 , 預(yù)防組對電擊記憶
在術(shù)后短期內(nèi)比模型組好。
2·2　 各組大鼠主動逃避反應(yīng)行為的測試結(jié)果 　⑴造
模后對各組大鼠主動回避反應(yīng) “獲得 ”的影響: 測
試結(jié)果表明模型組的正確回避率*低 , 且在隨后的繼
續(xù)訓(xùn)練中回避反應(yīng)的正確率增長*慢; 假手術(shù)組的正
確回避率高 , 在隨后的繼續(xù)訓(xùn)練中回避反應(yīng)的正確率
增長快; **組與預(yù)防組介于兩者之間。⑵造模損傷
后各組大鼠主動逃避反應(yīng) “保留 ”的改變: 結(jié)果表
明模型組大鼠的主動逃避反應(yīng)行為的 “保留 ”有嚴(yán)
重?fù)p害 , 而假手術(shù)組這種表現(xiàn)*輕 , **組在**一
段時間后對主動回避反應(yīng)的記憶恢復(fù)得比模型組好 ,
預(yù)防組對主動回避反應(yīng)的記憶在短期內(nèi)比模型組好。
2·3　Aβ**組化測試結(jié)果 　觀察經(jīng) Aβ**組化
測試后各切片 , 陽性表達(dá)細(xì)胞的胞漿呈淺棕黃色 , 陽抗 - PBS洗 -滴加 DAB, 室溫下 , 背光 (暗室 ) 顯
色 5～30 min, 鏡下控制反應(yīng)時間 , 有表達(dá)后蒸餾水
洗 5 min /次 × 3以中止反應(yīng) -封片 -在顯微鏡下觀察
計數(shù)。
1·7　 β2 APPmRNA的原位雜交測試 　主要步驟 ⑴石
蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30% H2O2 1份 +蒸餾水 10
份混合滅活內(nèi)源性酶 , 胃蛋白酶暴露 mRNA核酸片
段 , 0104%多聚甲醛 /011MPBS (pH 712～716) 后固
定; ⑵ 預(yù)雜交: 干雜交盒底部加 20%甘油 20 ml以保
持濕度 , 每張切片加預(yù)雜交液 20μl。恒溫箱 38～
42℃ 2～4 h。吸取多余液體 , 不洗; ⑶ 雜交: 按每張
切片 20μl雜交液 (β2 APPmRNA探針雜交液 ) 加在
切片上。恒溫箱 38～42℃雜交過夜; ⑷雜交后洗滌:
滴加封閉液 37℃ 30 min, 甩去多余液體 , 不洗; ⑸
滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃ 60 min或室溫 120
min, 用 PBS洗 5 min × 4。勿用其它緩沖液和蒸餾水
洗滌; ⑹ 染色、封片步驟同**組化。
1·8　 統(tǒng)計學(xué)處理 　使用 SPSS 1110統(tǒng)計軟件 , 所有
結(jié)果用 ? x ±s表示 , 各組間比較用方差分析 , 組間兩
性細(xì)胞出現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)等區(qū)域 , 細(xì)胞種類有神
經(jīng)元、大小膠質(zhì)細(xì)胞。各時間點**組化陽性細(xì)胞數(shù)
見表 1。資料顯示**組與模型組比較 , 在 12 h、1
d、3 d這三個時間點上 , 陽性細(xì)胞數(shù)目多少兩者差異
無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P > 0105) , 而在 7 d、14 d點 , 陽
性細(xì)胞數(shù)前者少于后者 ( t = 4133, P < 0105) ; 預(yù)防
組與模型組比較, 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點
上 , 陽性細(xì)胞數(shù)前者少于后者 ( t = 14113, P <
0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上 , 陽性細(xì)胞數(shù)
兩者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P > 0105)。
2·4　β2 APPmRNA的原位雜交測試結(jié)果 　觀察 β2
APPmRNA的原位雜交測試后的切片 , 陽性表達(dá)細(xì)胞
的細(xì)胞漿呈深棕黃色 , 細(xì)胞種類有神經(jīng)元、大小膠質(zhì)
細(xì)胞 , 陽性細(xì)胞出現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)等區(qū)域 , 各組
各時間點陽性細(xì)胞數(shù)目如表 1。**組與模型組比
較 , 在 12h、1 d、3 d這三個時間點上 , 陽性細(xì)胞數(shù)
目兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P > 0105 ) , 而在 7 d、
14 d點 , **組的陽性表達(dá)數(shù)目明顯少于模型組的陽
性表達(dá)數(shù)目 ( t = 4127, P < 0105) ; 預(yù)防組與模型組兩比較用 q檢驗。
2　 結(jié)果
2·1　 各組大鼠被動回避反應(yīng)行為測試結(jié)果 ?、旁炷?br>后各組實驗大鼠被動回避反應(yīng) “ 獲得 ”能力的改變:
模型組不能學(xué)會被動逃避反應(yīng) , 而假手術(shù)組大鼠則能
學(xué)會被動逃避反應(yīng) , **與預(yù)防組的學(xué)習(xí)能力介于上
比較 , 在 12 h、1 d、3 d這三個時間點上 , 預(yù)防組的
陽性表達(dá)點明顯少于模型組的陽性表達(dá)點 ( t
12138, P < 0101) , 而在 7 d、14 d這二個時間點上
兩者陽性表達(dá)點數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P
0105)。表 1　Aβ**組化、 β2 APPmRNA的原位雜交測試結(jié)果 　　( ? x ±s , n = 3)
　 組別 Aβ
12h 1d 3d 7d 14d
β2 APPmRNA
12h 1d 3d 7d 14d
　A模型組 46 . 3 ±
6 . 1101
63 . 0 ±
6 . 2451
51 . 0 ±
4 . 5826
29 . 7 ±
2 . 5166
22 . 3 ±
3 . 5118
123 . 0 ±
6 . 5574
100 . 7 ±
7 . 6376
79 . 3 ±
9 . 0737
43 . 0 ±
6 . 5574
27 . 7 ±
2 . 5166
　B**組 43 . 7 ±
4 . 7258
57 . 3 ±
5 . 7573
47 . 7 ±
2 . 5166
22 . 0 ±
3 . 60553
10 . 7 ±
1 . 52753
117 . 0 ±
2 . 0000
91 . 3 ±
4 . 5092
71 . 7 ±
6 . 1101
29 . 3 ±
6 . 02273
10 . 7 ±
5 . 03323
　C預(yù)防組 31 . 7 ±
4 . 16333
45 . 0 ±
5 . 56783
33 . 3 ±
3 . 05513
27 . 0 ±
3 . 0000
20 . 3 ±
2 . 5166
86 . 3 ±
10 . 11623
54 . 7 ±
12 . 66283
43 . 7 ±
10 . 50393
35 . 7 ±
3 . 5512
24 . 7 ±
6 . 0277
　D假手術(shù)組 2 . 0 ±
3 . 46433 3
3 . 3 ±
3 . 05503 3
1 . 7 ±
1 . 52753 3
0 ±
03 3
0 ±
03 3
23 . 0 ±
13 . 45363 3
22 . 3 ±
6 . 11013 3
13 . 0 ±
3 . 60553 3
10 . 0 ±
2 . 64573 3
8 . 3 ±
1 . 52753 3
　 空白組 0 ±
03 3
0 ±
03 3
7 . 3 ±
± 3 . 05513 3
6 . 7 ±
2 . 47213 3
　　注:與同時間點模型組相比, t≥2158,
3
P < 0105, t≥4146,
3 3
P < 0101
3　 討論
阿爾茨海默病是一種原發(fā)變性型老年癡呆 ,其特
征特病理改變有:腦組織內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑 ( SP)、 神經(jīng)
纖維纏結(jié) (NFTS)、 神經(jīng)元數(shù)量減少和顆粒空泡變性。
AD的發(fā)病機理十分復(fù)雜 ,可能是多因素相互作用的結(jié)
果 ,其中 Aβ異常表達(dá)是形成老年斑的關(guān)鍵因素 , tau蛋
白異常表達(dá)是形成 NFTS的關(guān)鍵因素。
異常 Aβ在持續(xù)性的大腦細(xì)胞損害中扮演了重要
AD中病理改變的影響。AR I等[ 9 ]
發(fā)現(xiàn)雌**無論在
Aβ作用之前、 還是作用之后 ,或同時給予 ,均可阻斷
Aβ的神毒性作用。本實驗研究結(jié)果表明紫河車對 AD
模型大鼠的干預(yù)對 AD模型大鼠腦組織中 Aβ增多與
沉積有減少作用 ,與預(yù)期相一致。紫河車干預(yù)后減少
AD模型動物腦組織內(nèi)部 Aβ的沉積增多。Aβ的沉積
的主要原因之一是 APP 的增多 , 所以一般認(rèn)為角色 ,其神經(jīng)毒性與 AD關(guān)系主要表現(xiàn)在以下幾方面:
打破鈣平衡和產(chǎn)生氧自由由 ,能夠增強谷氨酸毒性 ,誘
導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生 ,導(dǎo)致大腦血管機能障礙 ,誘導(dǎo)神經(jīng)
元凋亡 ,**神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)。因此 Aβ在研究
AD的實驗中常用作評價實驗效果的重要指標(biāo)之一[ 4 ]
。
He等[ 5 ]
用 OA注入大鼠的海馬區(qū) ,結(jié)果表明實驗
大鼠出現(xiàn)行為學(xué)異常 ,其腦組織 NFTS形成、 老年斑出
現(xiàn)、 Aβ表達(dá)增加等合乎 AD的病理改變。用 OA注于
實驗大鼠的杏仁核中 ,其設(shè)想是杏仁核屬邊緣系統(tǒng)部
分 ,而邊緣系統(tǒng)與記憶和情緒都有極密切關(guān)系[ 6 ]
。本
實驗結(jié)果顯示 ,造模后實驗大鼠行為學(xué)出現(xiàn)異常 ,如記
憶力衰退 ,認(rèn)知能力減弱 ,靜默少動等;化學(xué)檢測其腦
組織顯示有 Aβ及βAPPmRNA表達(dá)異常地增多;陽性
細(xì)胞在新皮層 ,海馬區(qū)等等都有出現(xiàn) ,并以神經(jīng)元和膠
質(zhì)細(xì)胞受損為主。
**方藥對 AD模型動物腦內(nèi)的 Aβ含量的影響
的研究是近幾年來開展的 ,研究結(jié)果表明**方藥確
有降低 AD模型動物腦內(nèi)的 Aβ含量作用。趙長安
等[ 7 ]
研究表明:**填精方能抑制 AlCl 3 引起的血清
Aβ的升高 ,糾正逃避行為方式異常 ,提高大鼠的逃避
正確率 ,縮短逃避潛伏期 ,改善學(xué)習(xí)記憶能力。陳云波
察βAPPmRNA的變化可以與 Aβ的變化相互印證 ,免
疫組化也可以與原位雜交相互印證。本實驗研究表
明 ,紫河車干預(yù) AD模型大鼠后 ,β2 APPmRNA的過度
表達(dá)受到抑制 ,這表明了紫河車抑制 β2 APPmRNA表
達(dá)可能是其改善 AD病理改變的機制之一。
AD的臨床表現(xiàn)為記憶力減退和認(rèn)知功能減退 ,獨
立生活能力降低等。中醫(yī)認(rèn)為 , AD一病 ,其病位在腦
與腎密切相關(guān) ,腦為元神之府 ,主記憶、 智慧;中醫(yī)理論
認(rèn)為,腎是先天之本 ,精神之舍 ,主水濟心 ,安志養(yǎng)神 ,
主骨生髓 ,充腦益智 ,腎病則髓空善忘 ,神亂意失。因
而腎精不足是 AD發(fā)病的主要病機。 《本草綱目 》 亦
云:“ 精與志皆腎經(jīng)之所藏也 ,腎精不足,則志氣衰 ,不
能上通于心 ,故迷惑善忘 ” 。楊柏燦等[ 10 ]
據(jù)臟腑及氣
血陰陽定性把 139例 Alzhei mer型癡呆分為 6個證型 ,
涉及腎虛的比較達(dá) 91137%。說明從腎論治是** AD
的主要治法之一。林長興等[ 11 ]
以調(diào)心方和**方治
療 AD進(jìn)行對照 ,發(fā)現(xiàn)調(diào)心方**有效率為 71111% ,
而**方則為 77114%。這充分說明中醫(yī)藥干預(yù)對 AD
模型動物的行為學(xué)改變的影響確有改善的作用。
本實驗中用于干預(yù) AD模型大鼠的紫可車是一味
**填精名藥 ,有助陽補精 ,益血**功效 ,臨床上用
βAPPmRNA的異常與 AD的形成也有密切的關(guān)系。觀等[ 8 ]
研究表明**益智方對被 Aβ 25～35損傷的 NG
108～15細(xì)胞有保護(hù)作用。本實驗用于干預(yù) AD模型
大鼠的紫河車為**填精名藥 ,從臨床實踐看 ,能減輕
AD病的癥狀。紫河車中某些成分如雌**等可能對
于腎氣不足 ,精血衰少所致諸證。如《日用本草 》 說紫
河車“ 主虛損勞極 ,癲癇 ,失志恍惚 ,安心養(yǎng)血、 **補
腎 ” 。章生銀[ 12 ]
用小鼠跳臺法觀察紫河車水煎液對由
東莨菪堿及亞硝酸鈉所致的小鼠記憶損傷過程的影響,