[ 摘 要] 目的: 探討柴胡注射液對學習記憶行為影響的機制。方法: 每天2 次給予小鼠腹腔注射不同劑量的柴胡注射液, 連續(xù)5 天后采用行為觀察和生化檢測相結合的方法, 研究柴胡注射液對小鼠學習記憶行為的影響, 包括劑量- 效應關系和時間- 效應關系以及腦內(nèi)超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 和NO 含量的變化。結果: 與注射生理鹽水的對照組相比, 在5 種劑量( 50 、100 、200 、400 和800 mg / kg) 中除了50 mg / kg 外, 其他4 種劑量的柴胡注射液均能顯著提高小鼠Y- 迷宮分辨學習的能力及24 h 記憶保持率, 其中400 mg / kg 劑量的****; *佳劑量的柴胡注射液易化記憶的作用在訓練后24 ~ 72 h 均顯著增強( P < 0.01 ) , 以24 h *為顯著; *佳劑量的柴胡注射液可顯著提高行為訓練后小鼠腦內(nèi)SOD 的活性( P < 0.01 ) 、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 水平( P < 0.01 ) 以及提高NO 含量( P < 0.01 ) 。結論: 適當劑量的柴胡注射液在一定時間內(nèi)具有提高小鼠學習記憶能力的功效, 該作用可能與伴隨的腦組織抗氧化能力提高和NO 含量改變有關。[ 關鍵詞] 柴胡; 學習記憶; 超氧化物歧化酶; 丙二醛; 一氧化氮學習和記憶是神經(jīng)科學研究中的一個重要領

域, 越來越多證據(jù)表明機體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生與學習記憶密切相關.近年來研究發(fā)現(xiàn), 柴胡對缺血再灌注引起的肝腎損傷具有保護作用, 其機制可能與抑制氧自由基形成有關, 但關于其對學習記憶的影響尚未有報道。因此, 本研究通過對柴胡小鼠學習記憶行為和腦內(nèi)生化指標的觀測, 初步探討柴胡改善學習記憶的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

昆明種小鼠, 雄雌各半, 體重18 ~ 22 g, 由東南大學公共衛(wèi)生學院動物實驗中心提供, 適應性飼養(yǎng)2 天后正式進入實驗。柴胡注射液( 每1 ml 含柴胡生藥1 g) 為陜西西安亞寶制藥廠生產(chǎn), 批號20030404 ; 腦內(nèi)超氧化物歧化酶( SOD) 測定試劑盒( 批號20031003 ) 、丙二醛( MDA) 測定試劑盒( 批號20031003) 、NO 測定試劑盒( 批號20031003) 及考馬斯亮蘭蛋白測定盒( 批號20031003 ) 均由南京建成生物工程公司提供。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組及給**法

將140 只小鼠隨機分成空白對照組、生理鹽水對照組、50 mg / kg 柴胡組、100 mg / kg 柴胡組、200 mg / kg 柴胡組、400 mg / kg 柴胡組和800 mg / kg柴胡組。各組小鼠按各自所配濃度0.2 ml / 10g 腹腔注射, 每天2 次, 間隔8 h , 連續(xù)給藥5 天, 生理鹽水對照組腹腔注射等體積生理鹽水。1.2.2 Y- 迷宮分辨學習的檢測方法小鼠分辨學習能力的檢測按文獻[ 5 ] 方法進行。1 天內(nèi)連續(xù)分段訓練小鼠, 每10 次為一段, 兩段間小鼠休息1 min , 一直訓練到10 次反應中有9 次正確反應( 即90% 的正確反應率) 作為學會的標準。記錄小鼠達到學會標準所需訓練的次數(shù), 次數(shù)越少, 說明學習能力越強。將給予柴胡處理的小鼠達到學會

標準所需訓練的次數(shù)與正常小鼠達到學會標準所需訓練的次數(shù)相比, 計算學習改善率, 反映小鼠學習能力改變的情況。間隔24 h 檢測小鼠在10 次訓練中的正確次數(shù), 代表小鼠的24 h 記憶成績。將小鼠的24 h 記憶成績與學會的標準相比, 計算24 h 記憶保持率。同法檢測小鼠的48 和72 h 記憶保持率。保持率越高, 說明動物的記憶力越好。1.2.3 小鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量及NO 含量的測定SOD 活性測定 小鼠行為檢測后, 立即斷頭處死, 冰上取大腦, 用生理鹽水制備10% 腦組織勻漿液, 4℃離心取上清液, 用721 型分光光度計在波長550 nm 處測定其光密度值, 并按公式算出SOD 的活性。MDA 含量的測定 小鼠行為檢測后, 立即斷頭處死, 冰上取大腦, 用生理鹽水制備2 % 腦組織勻漿液, 4 ℃離心取上清液, 用721 型分光光度計在532 nm 波長處測定其光密度值, 再按公式求出MDA 生成量。NO 含量的測定 實驗結束后小鼠立即斷頭處死, 冰上分離大腦, 去除嗅球和小腦, 用冰生理鹽水沖洗血跡, 再用濾紙擦干, 電子分析天平稱重, 按腦組織: 生理鹽水為0.5 g ∶1 ml 比勻漿, 以3 000 r / min,4℃離心15 min , 取上清液, 凍存待測。由專業(yè)技師嚴

格按照操作說明進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

用Grubb 法對實驗數(shù)據(jù)的可疑值進行取舍, 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( x ±s ) 表示, 組間比較采用t 檢驗。P < 0.05 為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 柴胡注射液對小鼠學習記憶影響的劑量- 效應關系Y- 迷宮行為檢測結果顯示, 不同劑量的柴胡注射液對小鼠分辨學習能力和記憶保持的影響并不一致。如表1 所示, 與生理鹽水對照組相比, 除50 mg / kg 劑量的柴胡注射液組對小鼠的分辨學習能力的影響無統(tǒng)計學意義外, 其他4 種劑量的柴胡注射液均顯著增強小鼠的分辨學習能力( P < 0.01 ) ,

呈明顯的劑量- 效應關系; 對記憶保持百分率而言,除50 mg / kg 劑量以外, 其他4 種劑的柴胡注射液都有明顯易化記憶的作用。與生理鹽水對照組相比,100 ~ 800 mg / kg 的劑量都顯著提高24 h 的記憶持率, 其中400 mg / kg 的****, 其記憶保持率提高34.45% 。

2.2 柴胡注射液對小鼠記憶影響的時間- 效應關系由上述量- 效關系說明400 mg / kg 的柴胡注射液對小鼠24 h 記憶保持的易化作用*佳。本實驗進一步用該劑量觀察了柴胡注射液對小鼠Y- 迷宮分辨學習的48 及72 h 記憶保持的影響。結果表明400mg / kg 的柴胡注射液易化記憶的作用在訓練后24 ~72 h 均顯著增強( P < 0.01 ) , 以24 h *為顯著, 雖然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明顯地優(yōu)于該時相的生理

2.3 柴胡注射液對小鼠腦組織SOD 活性和MDA生成的影響為探討柴胡注射液提高小鼠分辨學習能力, 增強記憶的腦內(nèi)機制, 空白對照組、生理鹽水對照組和*佳劑量( 400 mg / kg) 柴胡注射液組的小鼠行為檢測后進行腦組織SOD 活性和MDA 含量的測定。該劑量的柴胡注射液能明顯提高腦組織SOD 活性, 減少MDA 的生成( P < 0.01 ) 。

2.4 柴胡注射液對小鼠腦組織NO 含量的影響實驗發(fā)現(xiàn), 柴胡注射液400 mg / kg 能明顯提高正常小鼠腦內(nèi)NO 的含量( P < 0.01 ) 

3 討 論

學習記憶是大腦***的功能, 是衡量動物發(fā)育的重要指標。國內(nèi)外多采用建立條件反射的方法檢測動物的行為和**腦功能, 其中Y- 迷宮法廣泛應用*為廣泛。本實驗結果顯示: 柴胡注射液在一定劑量范圍內(nèi)能明顯提高小鼠在Y- 迷宮中的分辨學習能力和記憶的影響力; 其易化記憶的效應在訓練后24 h *佳, 雖然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明顯地優(yōu)于該時相的生理鹽水對照組, 其中*佳劑量組小鼠伴隨有腦組織中SOD 活性的提高和MDA 水平的下降。SOD 是機體抗脂質(zhì)過氧化酶促防御系統(tǒng)中的一個重要酶, 它能特異性**生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基。自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈式反應, 過氧化脂質(zhì)的分解終產(chǎn)物MDA 通過交聯(lián)、結合形成脂褐素, 損傷細胞膜, 引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障

礙, 在行為上表現(xiàn)為腦功能的衰退。因此, 本研究認為柴胡改善小鼠學習記憶功能可能與其伴有SOD 活性的提高, 從而增強SOD 終止自由基鏈鎖反應的作用, 間接減少MDA 的產(chǎn)生有關, 但具體機制還需深入探討。本實驗觀察到柴胡注射液*佳劑量組的小鼠腦

組織中NO 含量與生理鹽水組相比明顯提高( P <0.01 ) , 提示柴胡改善學習記憶能力的作用可能與其提高腦組織中NO 的含量關系密切。目前普遍認為海馬突觸效應的長時程增強( LTP ) 可能是學習記憶的突觸機制, NO 作為逆向信使參與LTP 的形成和維持過程。動物學習記憶過程中, 不同腦區(qū)的NO 水平增高, 本實驗結果與此相符。誠然, 也有研究發(fā)現(xiàn)伴有空間學習障礙的小鼠海馬部位的NO含量增多, NO 介導神經(jīng)毒性作用, 從而損傷學習記

憶功能。筆者推測這可能與NO 具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)營養(yǎng)的“雙刃劍樣”作用有關, 當NO 含量在合理范圍內(nèi)波動時, 可能介導神經(jīng)營養(yǎng)作用, 當NO 的含量過低或過高時, 則表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用。綜上所述, 適當劑量的柴胡注射液在一定時間內(nèi)具有提高小鼠學習記憶能力的功效, 該作用可能與其伴有腦組織抗氧化能力提高和NO 含量改變有關, 其機制值得進一步探討