摘　要　為研究HSF1基因缺陷小鼠的行為特征,探索HSF1基因在小鼠行為表現中的作用。選取6～7個月大雄性HSF1基因缺陷小鼠39只及野生型小鼠36只進行情緒性評分、曠場實驗、高架十字迷宮實驗、簡易迷津實驗、T- CAT實驗、獨木橋實驗和懸掛實驗以觀察其情緒性喚醒水平、焦慮水平、探索行為、工作記憶能力和運動能力。結果表明HSF1基因缺陷小鼠的情緒喚醒水平和焦慮水平較低、探索行為減少、T- CAT中轉換率較低,提示小鼠的

情緒、探索動機和工作記憶受HSF1基因的調控。

關鍵詞　HSF1,小鼠,基因,行為。

1　前言

　　20世紀70年代Tissieres發(fā)現果蠅在熱誘導下能合成一組蛋白質,命名為熱休克蛋白(HSPs)。隨后的研究發(fā)現機體在其它應激條件下也能合成HSPs。HSPs是一類在進化上高度保守的蛋白質,廣泛存在于原核和真核生物的細胞內。HSPs參與細胞內蛋白質折疊、裝配、降解和修復過程,在應激情況下可以保護細胞免受蛋白變性和降解變性蛋白,維持蛋白的自穩(wěn)系統(tǒng),保護機體免受應激的損傷,對于維持機體的自身穩(wěn)態(tài)起著重要作用。目前HSPs被認為是一種重要的應激蛋白。在HSP基因的TATA5’端上游有一回文結構,被稱為熱休克元件(HSE)。HSE由熱休克因子(HSF)所調控,熱休克因子包括HSF1、HSF2、HSF3、HSF4等,其中HSF1是*主要的調控因子,主要調控機體在應激狀態(tài)下HSPs的表達。缺乏HSF1的機體在應激條件下不能合成HSPs?！　⌒かI忠等構建了HSF1基因缺陷的小鼠模型,為研究HSPs提供了好的實驗動物模型。San2tos等發(fā)現HSF1基因缺陷小鼠的大腦出現了形態(tài)

學改變,鏡下觀察發(fā)現其大腦的室周組織中出現細胞空泡化、胞內出現無結構聚集物、核固縮等現象,這種改變表現為基因累積效應。但這些腦部結構的改變是否對小鼠神經系統(tǒng)功能產生影響及其影響程度,至今尚不清楚。很多研究表明,某些有重要生理功能的單個基因被敲除后,基因缺陷動物的行為會出現一系列的改變,如Lahdesmaki發(fā)現腎上腺受體α2基因缺陷的小鼠表現出豎毛行為增加,運動能力受損,焦慮行為增多以及晝夜節(jié)律的改變。Burne發(fā)現維生素D受體基因缺陷小鼠的運動功能明顯受損,但對于小鼠的認知功能不造成影響。HSF1基因在個體的應激反應中有著重要生理功能,HSF1基因缺陷也可能會導致個體出現很多的行為改變。我們在對HSF1在應激中的作用的研究過程中,觀察到HSF1基因缺陷小鼠在飼養(yǎng)籠內的自發(fā)性活動減少,除了自發(fā)活動改變外,是否還存在其它方面的行為改變?這些行為改變的原因是什么?為對這些問題作進一步的了解,本研究采用多種行為觀察方法從情緒性、探索行為、工作記憶能力以及運動能力四個方面對HSF1基因缺陷小鼠的行為進行評估,以探討HSF1對小鼠大腦功能的影響,為進一步的研究提供基礎。

2　材料與方法

2. 1　實驗動物及分組

　　24～28周齡雄性HSF1基因敲除小鼠39只(HSF1- / - ),野生型小鼠36只(HSF1+/ +)。實

驗動物從美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心引進,由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心繁殖。

2. 3　行為觀察指標

　　所有的動物均在上午9點開始依次進行以下7項行為學觀察實驗,完成一項實驗后放回原來的籠中休息20min。所有實驗均由兩名熟練掌握行為測驗方法的實驗人員共同進行評定。

2. 3. 1　情緒性水平評定　參照Ader等的方法按照吳大興等編制的中國地鼠情緒性水平評定量表進行評定

。具體方法如下:打開籠箱,用鑷子夾住小鼠尾巴,以是否困難來評定取出難易, 1～2次抓住,認為較易,記為0分; 3～4次認為困難,記為1分;大于等于5次認為極困難記為2分。夾住尾巴后,頭朝下,力度以鼠不掉地為準,然后觀察30s,以評定掙扎程度、發(fā)聲、排便;掙扎程度以鼠四肢不動或輕微掙扎記0分;四肢掙扎,背部彎曲,頭朝上但未達到尾部記1分;劇烈掙扎,翻身至尾部或者嘶咬鑷子記2分;發(fā)聲程度以被夾住后無叫聲或1～4次嘰嘰叫,間隔時間長記0分; 5～10次尖叫記1分;大于等于10次尖叫,急促,記2分;自發(fā)性排尿,以無排尿記0分;有排尿記1分;自發(fā)性排便,以無排便記0分;有排便記1分,將五項得分相加得出情緒性水平的總分,范圍為0～8分。

2. 3. 2　高架十字迷宮實驗　用高架十字迷宮實驗來測定動物的情緒喚醒度。實驗裝置為一木制黑色高架十字迷宮。迷宮包括兩條開放臂(50cm×10cm)和兩條閉合臂(50cm×10cm×40cm),由中央區(qū)(10×10cm)聯結,迷宮放置在50cm的高架上。實驗開始時把動物面朝閉臂放置,觀察5min活動情況。觀察指標為:開臂進入次數和時間,閉臂進入次數和時間。計算入臂次數、開臂次數在總入臂次數中的比率。

2. 3. 3　曠場實驗　曠場實驗是一個經典的行為學實驗,能很好的評定動物的情緒性水平以及在開放的陌生環(huán)境中的探索行為。實驗裝置為木制曠場(100cm×100cm×30cm),底部用筆劃分成25個20cm×20cm方格,沿墻格稱為周圍格,其余為中央格,將動物放置在中央格,觀察5min內活動情況。觀察指標為:中央格爬行次數,周圍格爬行次數,爬行總格數。

2. 3. 4　簡易迷津實驗　該實驗反映動物在較為封閉的環(huán)境中的自發(fā)探索行為。簡易迷津箱為一120cm×20cm×20cm木箱,以木板間隔成8格,隔板下方有容納小鼠通過的小洞,左中右隨機排列。木箱分為起始端和目的端。實驗時將小鼠放于起始端的方格內,觀察5min動物活動情況。觀察指標為: 5min爬行總格數。

2. 3. 5　T2CAT實驗　Gerlai發(fā)明的T- CAT方案基于動物探新的本能,能很好地測量出動物的探索動機和工作記憶能力。T- CAT包括兩條臂———起始臂(直臂)和目的臂(橫臂),均為75cm×12cm×20cm,兩臂交叉呈T型,起始臂的末端24cm處通過活動門隔出一個起始區(qū)。目的臂的兩個入口處也有活動門。整個實驗包括1次被動選擇測驗和14次主動選擇測驗。**次為被動選擇測驗,目的臂一端入口的活動門關閉,動物只能探索目的臂的一端,當實驗動物探索完目的臂并自行回到起始臂后,把起始臂的活動門關閉,動物在起始區(qū)內待5s。從

**次開始連續(xù)進行14次主動選擇測驗。同時打開兩個活動門,動物開始探索目的臂,當動物進入其中一端時,關上另一端的活動門。當動物完成探索回到起始臂后,關上起始臂的活動門,讓動物在起始臂內待5s,完成一次探索。隨后的2～14次探索均按以上程序進行。由于老鼠具有探新的本能,因此每次探索會傾向于進入上次探索未去的目的臂。記錄14次主動選擇測驗中的轉換次數,以及完成15次選擇所花時間。2. 3. 6　獨木橋通過實驗　采用獨木橋通過實驗來評定動物的運動平衡能力。實驗裝置為一個木制獨木橋(100cm×1cm),分為起始端和目的端,目的端有一小平臺(10cm×10cm)。獨木橋放置在30cm的高處。實驗開始時讓小鼠在平臺上適應5min后把小鼠放置在獨木橋的起始端,記錄動物到達目的平臺的時間,實驗限時1min,如果未完成或者從獨木橋上跌下均算失敗,時間記為60s。每只小鼠連續(xù)進行三次實驗,計算小鼠到達平臺三次的平均時間,每次試驗間隔1min。

2. 3. 7　懸掛實驗　采用懸掛試驗來評定動物的四肢肌力和運動平衡能力。懸掛實驗的器材為一根1m長的鐵絲(直徑2mm),平行置于離地50cm處,鐵絲的一端有一個逃生的入口。實驗時讓小鼠前肢抓緊鐵絲的一端,每次實驗3min,共進行3次,每次實驗之間間隔30s。如果小鼠能在鐵絲上懸掛4　討論我們的研究發(fā)現HSF1基因缺陷鼠和野生型鼠在多個行為測驗中都存在明顯差異,表現為情緒喚3min或者能移動到逃生入口算作實驗成功,記為1分;如果3min內從鐵絲上掉下算實驗失敗,記為0分。計算小鼠三次懸掛實驗的總分。

2. 4　數據處理

　　所有數據都采用獨立樣本t檢驗,差異顯著性設為p<0. 05,所有數據統(tǒng)計均在SPSS11. 5軟件包上完成。

3　結果

　　除3只HSF1基因缺陷鼠未能完成T- CAT實驗外,其余所有實驗小鼠均順利完成所有實驗項目。如表1中所列的實驗結果所示,HSF1基因缺陷鼠與野生型鼠比較在多項行為測驗中都表現出明顯的差異。