摘　要　為探討急性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠曠場(chǎng)行為的影響,以及腦神經(jīng)顆粒素(Neuroganin,NG)變化與應(yīng)激性行為效應(yīng)之間的相互關(guān)系。以急性不確定性空瓶刺激,建立情緒應(yīng)激動(dòng)物模型。將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為情緒應(yīng)激組1(ES1,接受情緒應(yīng)激和曠場(chǎng)測(cè)試)、情緒應(yīng)激組2(ES2,只接受情緒應(yīng)激)、正常對(duì)照組1(C1,無(wú)情緒應(yīng)激,但接受曠場(chǎng)測(cè)試)和正常對(duì)照組(C2,無(wú)情緒應(yīng)激,也無(wú)曠場(chǎng)測(cè)試) (n=10)。以曠場(chǎng)行為和高架十字迷宮任務(wù)來(lái)評(píng)定大鼠應(yīng)激后的行為變化,Western印跡雜交法(Westernblotting)測(cè)定海馬和前腦皮層中的NG含量和磷酸化水平。結(jié)

果表明: (1)應(yīng)激后ES1組的水平活動(dòng)增加,與C1組比較,差異有顯著性, p<0. 01; (2) ES1組海馬和前腦皮層的NG磷酸化水平高于C1和C2組,差異有顯著性,均為p<0. 05; ES2組的前腦皮層NG的磷酸化水平高于C1組,差異有顯著性,為p<0. 05; (3)海馬的NG磷酸化水平與水平活動(dòng)之間的相關(guān)達(dá)顯著水平。提示急性情緒應(yīng)激能導(dǎo)致動(dòng)物明顯的行為改變?nèi)缃箲],這種行為改變可能與腦內(nèi)NG磷酸化水平的變化有關(guān)。水平活動(dòng)可能是反映急性情緒應(yīng)激的較敏感行為指標(biāo),海馬NG磷酸化水平可能是預(yù)測(cè)急性情緒應(yīng)激所致焦慮或抑郁行為的較敏感生物學(xué)

指標(biāo)。

關(guān)鍵詞　急性應(yīng)激,情緒應(yīng)激,海馬,前腦皮層,行為,神經(jīng)顆粒素。

1　前言

　　迄今有關(guān)應(yīng)激引起行為改變的腦機(jī)制,包括所涉及的物質(zhì)分子、作用途徑和信號(hào)傳導(dǎo)方式所知甚少。以往的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)及功能的變化,也有用c - fos為探針進(jìn)行相關(guān)腦區(qū)的探索,但在應(yīng)激改變行為的腦機(jī)制的認(rèn)識(shí)上仍有許多謎團(tuán)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為突觸可塑性的改變就是應(yīng)激在**神經(jīng)系統(tǒng)留下的生物學(xué)“痕跡”,它會(huì)引起腦功能和行為活動(dòng)的改變。應(yīng)激過(guò)程中,**突觸可塑性機(jī)制的變化是涉及情緒和行為障礙發(fā)生的重要**機(jī)制,包括突觸結(jié)構(gòu)可塑性和突觸功能可塑性機(jī)制的變化。前者是指相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元的數(shù)量減少和細(xì)胞缺失、樹(shù)突棘萎縮等形態(tài)結(jié)構(gòu)的器質(zhì)性損害,其中海馬和前腦皮層是涉及應(yīng)激的*為重要的腦結(jié)構(gòu)。后者則是指蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑缺陷、突觸傳遞效能障礙等,以**NR依賴性LTP的改變*受關(guān)注

　　由于**神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)及其磷酸化反應(yīng)對(duì)維持突觸結(jié)構(gòu)和功能,包括突觸的生長(zhǎng)、發(fā)育、代償性變化和功能傳遞均具有十分重要的作用。所以,應(yīng)激后某些**神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)的含量和磷酸化水平變化,可能通過(guò)參與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性機(jī)制的改變,涉及到應(yīng)激所致行為效應(yīng)的**機(jī)制。近期研究表明,某些表達(dá)于**神經(jīng)元的蛋白質(zhì)如熱休克蛋白70(Heat Shockprotein- 70, HSP- 70)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderivedneurotro2phicfactor,BDNF)、膜生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(thepresynaptic43- kDa growth- associatedprotein, GAP- 43),與應(yīng)激和某些精神障礙發(fā)生密切相關(guān),使得研究者們開(kāi)始關(guān)注突觸特異性蛋白質(zhì)在應(yīng)激反應(yīng)的**機(jī)制中的可能角色。

　　神經(jīng)顆粒素(Neurogranin, NG)是一種神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì),在與應(yīng)激、情緒和行為密切相關(guān)的腦結(jié)構(gòu)如皮質(zhì)、海馬和杏仁核中高表達(dá),是突觸后PKC的重要底物蛋白。研究發(fā)現(xiàn),NG參與**NR依賴性LTP, PKC、PKA和CaMKⅡ等多種重要的蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑,通過(guò)介導(dǎo)突觸強(qiáng)度的改變,構(gòu)成誘發(fā)突觸可塑性表達(dá)的共同途徑的一部分,在突觸可塑性中具有關(guān)鍵作用。此外, NG能通過(guò)磷酸化水平的變化對(duì)**NR依賴性LTP過(guò)程產(chǎn)生明顯的影響,對(duì)某些應(yīng)激源的反應(yīng)敏感,并且與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。因此,它可能涉及到應(yīng)激所致行為障礙的突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),慢性生理應(yīng)激和情緒應(yīng)激能導(dǎo)致動(dòng)物行為異常以及NG含量的顯著下降,并且異常行為與NG含量的相關(guān)達(dá)顯著水平。表明慢性應(yīng)激后,NG含量下降是預(yù)測(cè)行為障礙發(fā)生的比較敏感的生物學(xué)指標(biāo),可能涉及慢性應(yīng)激所致行為障礙的**機(jī)制。上述研究結(jié)果提示, NG可能作為一9: 00～9: 10和晚21: 00～21: 10給動(dòng)物飲水,之后撤掉水瓶,其余時(shí)間不給水。定時(shí)喂水期結(jié)束后開(kāi)始應(yīng)激實(shí)驗(yàn), ES組動(dòng)物在定時(shí)喂水時(shí)間內(nèi)給予的空

瓶刺激誘發(fā)其情緒應(yīng)激,刺激的給予是無(wú)規(guī)律的,但維持**一次;應(yīng)激共持續(xù)3天。C1和C2組不接受任何處理,在籠中飼養(yǎng),自由飲水和攝食。所有動(dòng)物在適應(yīng)期開(kāi)始、適應(yīng)期末、定時(shí)喂水期末、應(yīng)激第3天共稱(chēng)四次體重以考察應(yīng)激的程度。

2. 3　儀器和試劑

　　**抗體抗NG總蛋白單克隆抗體、磷酸化NG多克隆抗體、β- Actin單克隆抗體、**抗體辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體、BCA(bicinchoninicacid)蛋白檢測(cè)試劑盒、全細(xì)胞裂解液(buffer)、硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter,NC)均為Sigma公司產(chǎn)品,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統(tǒng)購(gòu)自Bio- Rad公司。

2. 4　行為學(xué)測(cè)試

　　采用曠場(chǎng)測(cè)試和高架十字迷宮任務(wù)程序, ES1組和C1組動(dòng)物在適應(yīng)期末和應(yīng)激期末共進(jìn)行兩次行為測(cè)試。

2. 4. 1　曠場(chǎng)測(cè)試　將動(dòng)物置于高50cm、直徑180cm、周邊和底面均為黑色的圓形曠場(chǎng)中,光照度為60lux,室內(nèi)隔音。觀察者在行為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物在曠場(chǎng)內(nèi)5min的行為表現(xiàn),包括水平活動(dòng)距離、直立、修飾、探究、呆滯和排便量。其中水平活動(dòng)距離和探究通過(guò)行為跟蹤分析系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù),直立、呆滯、修飾行為是根據(jù)行為攝像儀統(tǒng)計(jì)發(fā)生的次數(shù)。每只動(dòng)物的排便量是以曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)束后排便的顆粒數(shù)來(lái)表示。2. 4. 2　高架十字迷宮任務(wù)　裝置高50cm,開(kāi)放吊臂為110cm×10cm×10cm(長(zhǎng)×高×寬),閉合吊臂為110cm×50cm×10cm(長(zhǎng)×高×寬)。測(cè)試于每天10∶00～14∶00h進(jìn)行。在測(cè)試開(kāi)始時(shí),大鼠被放

至迷宮的中間平臺(tái)上,面對(duì)迷宮的同一個(gè)開(kāi)放吊臂。

測(cè)試時(shí)間為5min,記錄4個(gè)行為指標(biāo)。(1)進(jìn)入迷

宮開(kāi)放吊臂總次數(shù), (2)在迷宮開(kāi)放吊臂中停留時(shí)

間, (3)進(jìn)入迷宮閉合吊臂總次數(shù), (4)在迷宮閉合

吊臂中停留時(shí)間。

2. 5　海馬和前腦皮層NG的測(cè)定

　　應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日,對(duì)ES1組和C1組大鼠進(jìn)行行為測(cè)試后,立即快速斷頭處死所有大鼠,剝離海馬和相同體積的前腦皮層組織,前腦皮層組織是根據(jù)大鼠腦圖譜確定的正中線靠近前外側(cè)的前額葉皮層組織(如圖1所示M1和M2區(qū)域)。之后將組織迅速用液氮冷卻。

　　采用Western印跡雜交法(Westernblotting)測(cè)定大鼠海馬和前腦皮層的NG含量和磷酸化水平。將組織加入buffer勻漿。勻漿后加入BCA液搖勻,在37℃水浴箱中溫育30分鐘,通過(guò)蛋白質(zhì)分光光度計(jì)進(jìn)行樣品海馬和前腦皮層總蛋白質(zhì)的初步定量,根據(jù)樣品總蛋白含量計(jì)算出每一樣品跑電泳所需加入的緩沖液量。勻漿中加入樣品緩沖液,走15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至NC膜,NC膜以封閉液(10%脫脂奶粉,溶于TTBS)室溫封閉1h,用Tris/Tween緩沖鹽水(TrisbufferedTween- 20sa2line, TTBS)洗膜, 10min(3次。加入抗NG總蛋白單克隆抗體室溫孵育3h,再用TTBS洗膜, 10min(3次。TTBS液稀釋山羊抗兔IgG抗體(1: 4000)孵

育,室溫,振蕩1h,同樣洗膜3次。加入ECL熒光標(biāo)記,以膠片曝光顯跡。之后,對(duì)同一張NC膜上的內(nèi)參蛋白β- Actin和磷酸化NG進(jìn)行雜交。通過(guò)Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統(tǒng)對(duì)膠片上的NG蛋白、磷酸化NG和β- Actin蛋白條帶進(jìn)

3　結(jié)果

3. 1　體重

　　適應(yīng)期開(kāi)始、適應(yīng)期末、定時(shí)喂水期末和應(yīng)激期末,四組動(dòng)物的體重總體比較差異無(wú)顯著性(p>0105)。但在應(yīng)激期內(nèi)(從定時(shí)喂水期末到應(yīng)激期末), ES1和ES2組動(dòng)物體重增長(zhǎng)非常緩慢。

3. 2　曠場(chǎng)行為測(cè)試

應(yīng)激前,兩組動(dòng)物在曠場(chǎng)測(cè)試中水平活動(dòng)距離、直立次數(shù)、修飾行為、呆滯行為和排便量的比較差異無(wú)顯著性(p>0. 05)?！?yīng)激后, ES1組表現(xiàn)出水平活動(dòng)增加,與C1組比較,差異有顯著性(p<0. 01)。其余行為指標(biāo)的比較差異無(wú)顯著性。